Noticias

Dec 02, 2023

Medicamentos seguros con alto potencial para bloquear la transmisión de malaria revelados por un bazo

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1951 (2023) Citar este artículo

1515 Accesos

9 Altmetric

Detalles de métricas

Los parásitos de la malaria como Plasmodium falciparum se multiplican en los glóbulos rojos (RBC), que son eliminados del torrente sanguíneo por el bazo cuando se altera su deformabilidad. Por lo tanto, la rigidez inducida por fármacos de los glóbulos rojos infectados por Plasmodium falciparum debería inducir su eliminación del torrente sanguíneo. Aquí, con base en este enfoque mecánico original, identificamos medicamentos seguros con un gran potencial para bloquear la transmisión de la malaria. Mediante el cribado de 13 555 compuestos con microfiltros miméticos del bazo, identificamos 82 que se dirigen a la forma transmisible circulante de P. falciparum. NITD609, un inhibidor de PfATPasa administrado por vía oral con efectos conocidos en P. falciparum, eliminó y endureció las etapas de transmisión in vitro en concentraciones nanomolares. Las exposiciones cortas a TD-6450, un inhibidor del virus de la hepatitis C NS5A administrado por vía oral, endurecieron las etapas del parásito de transmisión y mataron las etapas asexuales in vitro a altas concentraciones nanomolares. Un estudio de fase 1 en humanos con un resultado de seguridad primario y un resultado farmacocinético secundario (https://clinicaltrials.gov, ID: NCT02022306) no mostró eventos adversos graves con dosis únicas o múltiples. El modelo farmacocinético mostró que estas concentraciones pueden alcanzarse en el plasma de sujetos que reciben cursos cortos de TD-6450. Esta pantalla fisiológicamente relevante identificó múltiples mecanismos de acción y medicamentos seguros con un gran potencial como agentes bloqueadores de la transmisión de la malaria que podrían probarse rápidamente en ensayos clínicos.

Entre 2000 y 2015, la incidencia y la mortalidad por paludismo se redujeron en un 27 % y un 50 %, respectivamente. El descenso de la incidencia se detuvo entre 2015 y 2019, e incluso en 2020 hubo un preocupante reaumento tanto de la incidencia como de la mortalidad; con 241 millones de casos relacionados con malaria y 627.000 muertes1. La aparición de cepas de P. falciparum resistentes a la artemisinina en el sudeste asiático2,3,4 y recientemente en África5,6 amenaza aún más el control de la enfermedad. Por lo tanto, se prevé que el bloqueo de la transmisión de P. falciparum de su huésped humano a su mosquito vector reduzca la incidencia de la malaria y, con suerte, contribuya a su erradicación mundial7. Los gametocitos en etapa V, las etapas sexuales maduras de los parásitos de la malaria, son la única forma que se transmite al vector de la especie Anopheles y su bajo número crea un cuello de botella natural en el ciclo de vida del parásito, lo que los convierte en un buen objetivo para bloquear la transmisión del parásito8.

El bazo retiene los eritrocitos rígidos y los elimina de la circulación9,10. Cualquier eritrocito no pasará más de dos horas en la circulación antes de pasar a través de estrechas hendiduras interendoteliales en las paredes de los senos esplénicos11,12. En la malaria, solo las etapas más deformables, a saber, los anillos (etapa asexual inmadura) y los gametocitos en etapa V, pueden superar este desafío mecánico y persistir en la circulación8,13,14,15,16. El cambio de gametocitos inmaduros rígidos a maduros deformables ocurre al final de su proceso de maduración de 10 a 12 días, entre las etapas IV y V13,16. Por lo tanto, el endurecimiento inducido por fármacos de los gametocitos en etapa V debería eliminarlos del ciclo de transmisión. Se han explorado varios enfoques de detección para identificar compuestos dirigidos a gametocitos capaces de matar o inactivar el parásito17,18,19,20,21,22. Estos enfoques han identificado dianas candidatas interesantes que muestran una capacidad farmacológica variable. Recientemente, se han puesto a disposición grandes bibliotecas de medicamentos susceptibles de reutilización23. Esto ofrece la oportunidad de identificar candidatos efectivos y de rápido despliegue para bloquear la transmisión24. Con el objetivo de encontrar objetivos de parásitos, hemos establecido un enfoque fisiológicamente relevante para examinar miles de compuestos por su actividad de rigidez en los eritrocitos parasitados.

Nuestro enfoque utiliza un método de filtración mimético esplénico, llamado microfiltración, que cuantifica la capacidad de los eritrocitos para pasar entre las microesferas25. Este método se adaptó a la detección de drogas26,27,28 y luego se combinó con la evaluación de la eliminación de parásitos basada en la tinción mitocondrial activa19. Para el presente trabajo, utilizamos este enfoque biomimético para seleccionar más de 12 000 compuestos de una biblioteca de reutilización por su capacidad para inducir la retención de gametocitos maduros de P. falciparum en el bazo humano.

La selección se realizó como se describió previamente27. Brevemente, los gametocitos maduros en etapa V (cepa NF54) se cultivaron in vitro, luego se expusieron a los compuestos explorados y luego se filtraron a través de capas de microesferas (microfiltración)25,28. La actividad de endurecimiento se determinó comparando la gametocitemia aguas arriba y aguas abajo de las capas de microesferas después de la filtración de los gametocitos expuestos al fármaco en placas de 384 pocillos utilizando un colector de vacío. La gametocitemia se evaluó mediante tinción de ADN (Sybr Green) y membrana de eritrocitos (CellMask). El efecto letal se evaluó mediante tinción con MitoTracker19. Examinamos dos bibliotecas pequeñas, específicamente Pathogen Box de Medicine for Malaria Venture y Kinase Inhibitors Box de GSK (400 y 350 compuestos, respectivamente, Fig. 1A, B), y además la biblioteca de reutilización ReFrame más grande (12,805 compuestos, Fig. .1C).

Cascada de progresión de cribado de tres bibliotecas diferentes: Malaria Pathogen Box (A), Kinase Inhibitor Box (B) y ReFrame library (C). Se sometieron 3 aciertos del cribado primario a un análisis de dosis-respuesta junto con 12 compuestos que se encontraron activos en algunas, pero no en todas, las réplicas del cribado. Se confirmaron los 3 aciertos, pero ninguno de ellos fue seleccionado para una posterior validación posterior a la selección. B Cuatro aciertos del cribado primario junto con 5 compuestos que se encontraron activos en algunas, pero no en todas, las réplicas del cribado se sometieron a un análisis de dosis-respuesta que generó 3 aciertos confirmados. Ninguno de ellos fue seleccionado para una posterior validación posterior a la selección. Los aciertos de C 112 del cribado primario se sometieron a un análisis de dosis-respuesta, lo que generó 74 aciertos confirmados. Se agregaron 63 compuestos con resultados no interpretables durante la selección primaria a los aciertos para el análisis de dosis-respuesta, lo que generó dos aciertos confirmados adicionales. Los 76 aciertos confirmados se asignaron a siete grupos (paneles de la derecha), en función de su actividad y diana molecular. Para cada grupo, se ha seleccionado un éxito representativo a modo de ilustración. La puntuación de aciertos basada en la vía de administración, la seguridad en sujetos humanos y la farmacocinética dio como resultado la selección de 3 fármacos que se sometieron a los experimentos de confirmación finales (azul oscuro).

El cribado primario se repitió seis o tres veces para bibliotecas pequeñas (inhibidores de cinasa y cajas de patógenos). Los aciertos se seleccionaron placa por placa, en función de la regresión lineal de las distribuciones de compuestos en los gráficos de resultados de detección (Fig. 2C, D). Encontramos tres y cuatro aciertos respectivamente en las cajas de inhibidores de cinasa y patógenos (Fig. 1A, B). Sus respectivas tasas de éxito fueron 0,75% y 1,14%. Los compuestos activos en algunas, pero no en todas, las réplicas de cribado se añadieron a los aciertos para su posterior análisis. La biblioteca ReFrame más grande se proyectó en singular, con 112 aciertos (tasa de aciertos del 0,87 %, Fig. 1C). Los golpes detectados tenían una actividad de rigidez predominante (44 %), un efecto letal predominante (28 %) o una combinación de ambos (28 %, Fig. 2A, B). Los valores de Z' estaban entre 0,4 y 0,7 (Fig. S1). Estos 112 aciertos, más 63 compuestos (0,6 %) con resultados no interpretables en el cribado primario se exploraron más a fondo.

Diagramas de dispersión de salida de detección representativos para las bibliotecas específicas (A) y ReFrame (B), y para 2 placas individuales de la detección primaria de ReFrame, con NITD609 (C) y TD-6450 (D) como aciertos finalmente seleccionados. En el panel A, "K" se refiere a la caja de inhibidores de cinasa y "P" se refiere a la caja de patógenos. Las tasas de muerte y retención están en los ejes x e y, respectivamente. Controles negativos (cuadrados rojos) y controles positivos que incluyen caliculina A 75 nM para actividad de endurecimiento (triángulos verdes), violeta de genciana 50 µM para efecto letal (círculos verdes) y NITD609 0,5 µM para efecto combinado de endurecimiento y exterminio (cuadrados verdes), caída dentro y fuera de la nube principal de compuestos de prueba inactivos (círculos grises vacíos) definidos por regresión lineal +/-95% de bandas de predicción SD (línea completa y líneas punteadas, respectivamente). Los aciertos fueron confirmados por DRA (X azul) o no (triángulos azules vacíos). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se seleccionaron 119 aciertos para el análisis de dosis-respuesta (DRA): tres de Pathogen Box, cuatro de Kinase Inhibitors Box y 112 de la biblioteca ReFrame. La confirmación del efecto endurecedor, el efecto letal o la coexistencia de ambos fue el criterio para el análisis posterior de los impactos. Se obtuvieron valores de IC50 tanto para el efecto letal como para la actividad de refuerzo (Fig. 3, Tabla S1), pero no se utilizó ningún valor de corte de IC50 para una mayor priorización de impactos. Los aciertos se despriorizaron cuando no se pudo determinar IC50. Se confirmaron seis de los siete aciertos de las cajas de inhibidores de cinasas y patógenos (tasa de confirmación del 86 %, Fig. 1A, B). También se seleccionaron para DRA otros 17 compuestos (12 de la caja de patógenos y 5 de la caja de inhibidores de cinasa) que mostraron efectos en algunas pero no en todas las réplicas de detección. Ninguno de ellos fue confirmado como activo.

Curvas dosis-respuesta y estructuras químicas de los 3 aciertos seleccionados: NITD609 (A), TD-6450 (B) y L-THP (C). TD-6450 era un enantiómero puro. Los estereocentros son: (S)−1-((S)−2-(5-(4'-(6-((2 R,5 S). Los datos se presentan como valores medios +/− SEM. Para NITD609 y L -THP, n = 2 experimentos independientes, para TD-6450, n = 4 experimentos independientes Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los tres éxitos confirmados por DRA de Pathogen Box, a saber, MMV020081, MMV667494 y MMV030734, se identificaron en evaluaciones previas de esta biblioteca dirigidas a gametocitos29,30,31. Dos de ellos, MMV667494 y MMV030734, mostraron una alta actividad letal específica para la formación de gametos femeninos (Tabla S2). MMV667494 y MMV030734 indujeron la rigidez de los gametocitos en concentraciones inferiores a las que inducen la muerte. Todos los aciertos confirmados de la Caja de inhibidores de cinasa tenían el mismo andamiaje químico (Tabla S2). Se agregó a esta lista un análogo químico, que no se probó en la detección primaria, y se probó en DRA. Este compuesto mostró valores de IC50 cercanos a los de los impactos más potentes (2,44 y 0,8 µM para matar y retener, respectivamente, Tabla S2) y se usó para una posterior validación posterior a la selección. Los aciertos confirmados de la biblioteca ReFrame tenían una actividad de rigidez predominante (40 % de los aciertos), un efecto letal predominante (30 %) o una combinación de ambos (30 %) (Tabla S1).

De los 112 resultados de la biblioteca ReFrame, 74 fueron confirmados por DRA (tasa de confirmación del 66 %, Fig. 1C). También se seleccionaron para DRA 63 compuestos adicionales con resultados no interpretables en el cribado primario. Para 15 de estos 63 compuestos, el pozo correspondiente de la placa de microfiltración de 384 pozos no estaba operativo debido a la fuga de microesferas, un evento raro27. Para 46 compuestos, el microscopio no pudo capturar al menos una imagen legible. Finalmente, probamos sildenafil y tadalafil por DRA. Aunque estos 2 fármacos no fueron capturados por la detección primaria, se informó anteriormente que inducen la rigidez de los gametocitos en etapa V32,33. Se obtuvieron valores de IC50 tanto para el efecto letal como para la actividad de rigidez o, en algunos casos, uno de ellos (Fig. 3, Tabla S1). Encontramos dos aciertos confirmados entre esos 63 compuestos, lo que está en línea con la tasa de aciertos de toda la campaña de detección (0,87%). Estos dos éxitos fueron L-tetrahidropalmatina (L-THP) y piritionato de zinc.

En la Tabla S2 se indican las estructuras, los objetivos y los resultados de los enfoques de detección anteriores con respecto a los aciertos confirmados de la caja de patógenos y la caja de inhibidores de cinasa. Los aciertos de la biblioteca ReFrame se dividieron en siete grupos (Fig. 1 y Tabla S1) en función de objetivos moleculares conocidos en sujetos humanos o indicaciones médicas: inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) (9 aciertos); glucósidos cardíacos dirigidos a la bomba ATPasa de sodio-potasio (7 hits); inhibidores de cinasa y fosfatasa (6 aciertos); inhibidores de la monoaminooxidasa (MAO) como el azul de metileno (2 hits)34, candidato que bloquea la transmisión de la malaria, también seleccionado por campañas previas de cribado de gametocitos35,36; agentes antipalúdicos (6 aciertos); agentes antibióticos/antivirales (18 aciertos) y un grupo final de compuestos no asignables a un grupo definido (28 aciertos). Se enumeraron los objetivos moleculares conocidos de los impactos en células humanas, bacterias, virus o parásitos (Tabla S1). El análisis de homologías en P. falciparum puede identificar vías para la destrucción y/o el endurecimiento de los gametocitos aún por caracterizar.

Los éxitos de la biblioteca ReFrame se seleccionaron además en función de la seguridad, preferiblemente la administración oral (puntuación alta si es oral) y la disponibilidad potencial para un uso generalizado. Brevemente, se excluyeron los hits seleccionados que no se administraron por vía oral en modelos animales o en sujetos humanos (se excluyeron 44 hits confirmados de 76). Luego, los 32 hits restantes se clasificaron por seguridad y PK. Como la antitransmisión impone una seguridad casi perfecta, se excluyeron los fármacos que presentaron eventos adversos graves. Finalmente, se exploraron más a fondo los hits con la mejor ventana terapéutica (pico sérico mayor o cercano a IC50). Por ejemplo, MMV-390048, un fármaco antipalúdico con un buen perfil de seguridad, se excluyó de un análisis posterior debido a una ventana terapéutica inexistente o muy estrecha (IC50 3,5-3,9 µM, concentración sérica máxima 2,8 µM37). Los tres fármacos más atractivos según esta selección fueron NITD609, L-THP y TD-6450 (Tabla 1). NITD609, también conocido como cipargamin, es un potente inhibidor de la ATPasa 4 de P. falciparum. Muestra un fuerte efecto letal en concentraciones nanomolares, tanto en estadios de parásitos asexuales como sexuales38,39 y una actividad endurecedora en parásitos asexuales40. NITD609 se está probando actualmente en un gran ensayo de fase 2 en varios sitios en África. Los presentes resultados confirmaron su efecto conocido sobre los gametocitos41 pero, además, revelaron su actividad endurecedora sobre los gametocitos maduros (Figs. 2C y 3A), que se espera que induzca una eliminación muy rápida de las formas transmisibles presentes en la circulación en el momento del tratamiento. L-THP es un alcaloide con efectos ansiolíticos y sedantes actualmente en desarrollo en el contexto de trastornos psiquiátricos y conductas adictivas42. Sin embargo, también tiene un efecto conocido en los estadios asexuales de P. falciparum43. Los análisis en el presente ampliaron su espectro antimalárico a las etapas sexuales del parásito (Fig. 3C). TD-6450 es un inhibidor de NS5A desarrollado para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C. A pesar de las sólidas indicaciones de excelente seguridad (Tabla 2) y eficacia anti-VHC similar a la de otros miembros de esta familia de fármacos, el desarrollo de TD-6450 como terapia para la hepatitis C se detuvo después de la Fase 2 por razones estratégicas. L-THP no se exploró más porque, a pesar de su actividad conocida de etapas asexuales43, su actividad de rigidez no se confirmó por completo en la evaluación posterior. TD-6450 y NITD609 se mantuvieron para exploraciones adicionales en el presente estudio.

Las actividades de endurecimiento de TD-6450 y dos compuestos de control, a saber, NITD609 y GSK1321730A, fueron confirmadas por DRA con una cepa del parásito (3D7) distinta a la utilizada durante la selección (NF54). Esta confirmación se realizó en un laboratorio diferente (París frente a Madrid) utilizando un formato de microplaca diferente (96 pocillos en París frente a 384 pocillos en Madrid). La mediana de TD-6450 (± SD) IC50 fue de rango submicromolar (0,28 ± 0,58 µM, cinco experimentos independientes). Las tasas de retención normalizadas mostraron efectos significativos tanto para NITD609 (66 %, p < 0,0001) como para TD-6450 (27 % p < 0,0001, Fig. 4B), con una mayor actividad de rigidez para NITD609 en comparación con TD-6450. La combinación de NITD609 y TD-6450 mejoró significativamente la rigidez de los gametocitos en comparación con cualquiera de los fármacos utilizados solos, es decir, 73 % frente a 66 % para NITD609 (p = 0,0058) y frente a 27 % para TD-6450 (p < 0,0001) (Fig. 4B). También se analizó la sostenibilidad del endurecimiento inducido por fármacos. Los gametocitos se cultivaron con exposición a los fármacos durante 24 horas y las retenciones se volvieron a medir mediante microfiltración 24 h más después del lavado del fármaco (Fig. 4C). En este entorno, TD-6450 mostró una mejor actividad de rigidez sostenida que NITD609 (43 % frente a 23 %, p = 0,0525) (Fig. 4C). Las observaciones microscópicas confirmaron el conocido efecto de hinchazón del parásito mediado por NITD609, mientras que no se observaron cambios morfológicos en los gametocitos expuestos a TD-645044. Esta observación fue confirmada por los valores de relación de aspecto obtenidos por citometría de flujo de imágenes (Fig. 4A). Las IC50 de TD-6450 durante la campaña de selección (en Madrid) fueron de 455 ± 304 nM o 2,03 ± 0,35 µM cuando se tiñeron respectivamente todos los gametocitos o solo las hembras (2 experimentos). Estas diferencias dependientes de la lectura sugieren que TD-6450 es predominantemente activo en los gametocitos masculinos, como se observó anteriormente con varios compuestos antigametocitos18, lo que posiblemente explique el efecto parcial aparente con este fármaco.

Eritrocitos teñidos con Giemsa infectados por un gametocito maduro de P. falciparum expuesto durante 24 horas a DMSO (control negativo, borde verde), TD-6450 5 µM (borde azul) y NITD609 1 µM (borde rojo). Se comparó la circularidad de los gametocitos mediante citometría de flujo de imágenes midiendo la relación de aspecto que mostró una diferencia significativa entre DMSO y NITD609. El experimento se realizó una vez. B Diagrama de puntos acumulativo de 5 experimentos de microfiltración donde los gametocitos en etapa V de P. falciparum (cepa 3D7 pULG8-GFP) se expusieron durante 24 horas a TD-6450 (azul), NITD609 (rojo) o la combinación de ambos (púrpura). C Gráfico de puntos acumulativo de 4 experimentos de microfiltración en los que los gametocitos se expusieron a los fármacos durante 24 h y se mantuvieron en cultivo durante 24 horas más después de retirar el fármaco. Los puntos indican la tasa de retención de pocillos individuales de placas de microfiltración de 96 pocillos. Para B, C, cada experimento se realizó con una sola inducción de gametocitos y se cargó una sola columna de 8 pocillos para cada condición, a menos que la población de gametocitos cultivados no fuera lo suficientemente grande como para llenar toda la columna. Los números de repeticiones son, de izquierda a derecha: 40 (8 para cada experimento), 40 (8 para cada experimento), 32 (8 para cada uno de los 4 experimentos), 32 (8 para cada uno de los 4 experimentos). Los diagramas de caja indican las medianas y los IQR. La exposición a DMSO (verde) fue el control negativo. Los valores de P y F después de la prueba ANOVA de una vía fueron inferiores a 0,0001 e iguales a 110 (B) e iguales a 0,0005 y 6,365 (C), respectivamente. Leyenda de los valores p individuales: *p = 0,05–0,01, **p = 0,01–0,001, ***p = 0,001–0,0001, ****p < 0,0001. Los valores de p individuales, cuando son superiores a 0,0001, son: panel B, NITD609 frente a combinación, 0,0058. Panel C, DMSO frente a NITD609, 0,0096. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Con respecto a la eficacia de TD-6450 en parásitos asexuales, IC50 fue 875 ± 205 nM en 3D7 y 1,33 ± 0,23 µM en cepas NF54 (2 experimentos, Fig. 5B). La observación microscópica de los frotis teñidos con Giemsa confirmó la inflamación de los anillos expuestos a NITD609, mientras que los anillos asexuales expuestos a TD-6450 mostraron maduración tardía y picnosis sin inflamación (Fig. 5A y Fig. S2), lo que sugiere que estos fármacos operan a través de diferentes mecanismos. Para evaluar la capacidad de P. falciparum para desarrollar resistencia contra TD-6450, expusimos parásitos de la línea F32-TEM, una cepa de referencia de P. falciparum sensible a la artemisinina45, al fármaco en una concentración de 3 µM durante tres días. Confirmamos la ausencia de parásitos en frotis teñidos con Giemsa después de la exposición, luego verificamos diariamente la reaparición de parásitos en un matraz de cultivo libre de drogas. Observamos un cambio de 3,5 y 1,5 veces en el IC50 de TD-6450 en parásitos45 expuestos a cinco o diez de estos pulsos de eliminación de drogas, respectivamente (Fig. 5C), sin acortar el tiempo de rebrote desde el primero hasta el último pulso. Este bajo nivel de cambio de IC50 sugiere que no hay una aparición rápida de parásitos marcadamente resistentes a TD-6450 in vitro.

Eritrocitos teñidos con Giemsa infectados por una fase anular de P. falciparum expuestos a DMSO (control negativo, borde verde), TD-6450 5 µM (borde azul) y NITD609 1 µM (borde rojo). Las observaciones al microscopio óptico se repitieron 5 veces. B Dosis-respuesta de P. falciparum en estadio anular sincronizado (cepas NF54 y 3D7 pULG8-GFP), expuesto durante 48 h a TD-6450 (azul) y NITD609 (rojo). C Respuesta a la dosis de la cepa F32-TEM antes (azul oscuro) o después de 5 (azul) o 10 (azul claro) pulsos de fármaco con TD-6450. Cada punto muestra la media (±SD) de 3 repeticiones. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

TD-6450 fue descubierto y desarrollado para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C por Theravance Biopharma Inc, pero se detuvo después de la fase II por razones estratégicas. El primer ensayo clínico de fase I se completó en 2014 (identificación de ensayos clínicos: NCT02022306). El objetivo principal de este estudio fue evaluar la seguridad y la tolerabilidad de la dosis única ascendente (SAD) y la dosis múltiple ascendente (MAD) en sujetos sanos (Tabla 2). El objetivo secundario fue determinar la farmacocinética (PK) de TD-6450 en sujetos sanos tanto para SAD como para MAD. Los datos de PK obtenidos de este estudio de fase I se usaron para hacer un modelo de concentración-tiempo. La bondad de ajuste fue alta (Fig. 6A) con datos de estudios de dosis ascendente única (SAD) y dosis ascendente múltiple (MAD) realizados en voluntarios sanos (Fig. 6B, C). Las siguientes relaciones de covariables adicionales se mantuvieron en el modelo final: dosis sobre biodisponibilidad relativa, implementada como una función de palo de hockey que resultó en una disminución lineal en la biodisponibilidad relativa de dosis de 240 mg a 500 mg (es decir, una disminución del 24,7 % por aumento de 100 mg en dosis, por encima de 240 mg); el aclaramiento de la dosis por eliminación se implementa como una función de saturación que alcanza la saturación total a la dosis más alta; duración del tratamiento sobre la biodisponibilidad relativa implementada como una función de saturación alcanzando la saturación completa en la dosificación de estado estacionario; la ingesta de alimentos sobre la biodisponibilidad relativa, implementada como un efecto covariable categórico (es decir, 68,5 % más de biodisponibilidad cuando se administra con alimentos); y la ingesta de alimentos sobre la tasa de absorción implementada como un efecto covariable categórico (es decir, un 93,3 % más de tiempo de absorción cuando se administra con alimentos) (Tabla 3).

Bondad de ajuste (A) del modelo farmacocinético final. Diagnóstico basado en simulación (n = 2000 simulaciones independientes) (pvcVPC), que muestra el rendimiento predictivo del modelo PK final, estratificado en dosificación única (B) frente a dosificación múltiple (C). Theravance Biopharma puso a disposición los datos PK utilizados para realizar el modelado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Según el resultado del modelo, se generaron simulaciones de concentración-tiempo (Fig. S3) de dosis única de 1000 mg sin (Fig. 7A) y con (Fig. 7B) alimentos. Según el modelo, una concentración plasmática de 200 nM, que endurece significativamente los gametocitos maduros tras una exposición de ocho horas (Fig. 7C), se mantendrá durante al menos 8 horas en el 90 % y el 100 % de la población con una dosis única de 1000 mg administrados sin o con alimentos. Esta concentración (200 nM) es el mejor compromiso entre la cobertura de toda la población (incluidas todas las covariables de modelado) y la actividad de rigidez in vitro de TD-6450 que se espera se traduzca en una eliminación marcada in vivo.

Perfiles farmacocinéticos poblacionales simulados de una dosis oral única de TD-6450 cuando se administra en ayunas (A) y con alimentos (B), en voluntarios sanos. Las líneas continuas negras son los perfiles medios de la población y el área gris sombreada muestra el intervalo de predicción del 90 %. Las líneas discontinuas rojas indican una concentración de 200 nM, asociada con un endurecimiento significativo de los gametocitos maduros. Theravance Biopharma puso a disposición los datos PK utilizados para realizar el modelado. C Gráfico de puntos acumulativo de 3 experimentos de microfiltración en los que los gametocitos se expusieron a los fármacos durante 8 h, se diluyeron por un factor de 10 y luego se filtraron después de 24 h. Los puntos indican la tasa de retención de pocillos individuales de placas de microfiltración de 96 pocillos. Cada experimento se realizó con una sola inducción de gametocitos y se cargó una sola columna de 8 pocillos para cada condición, a menos que la población de gametocitos cultivados no fuera lo suficientemente grande como para llenar toda la columna. Los números de repeticiones son, de izquierda a derecha: 23 (8 para los primeros 2 experimentos, 7 para el tercero), 16 (8 para cada uno de los primeros 2 experimentos), 23 (8 para los primeros 2 experimentos, 7 para el tercero ), 7 (solo 3er experimento) y 7 (solo 3er experimento). Los diagramas de caja indican las medianas y los IQR. La exposición a DMSO (verde) fue el control negativo. Los valores de P y F después de la prueba ANOVA de una vía fueron inferiores a 0,0001 e iguales a 12,09, respectivamente. Leyenda de los valores p individuales: *p = 0,05–0,01, **p = 0,01–0,001, ***p = 0,001–0,0001, ****p < 0,0001. Los valores de p individuales, cuando son superiores a 0,0001, son: DMSO frente a TD-6450 200 nM, 0,0284. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Usando un enfoque mimético esplénico adaptado a la detección de alto rendimiento, identificamos 82 compuestos o medicamentos que endurecen o matan las etapas de transmisión de P. falciparum, la especie responsable de los ataques más graves y fatales de malaria. Tres de los fármacos activos identificados son seguros para su uso en humanos y se administran por vía oral. La combinación de dos de ellos, NITD609 y TD-6450, induce altas tasas de retención de gametocitos de P. falciparum en filtros miméticos de bazo. La retención esplénica da como resultado la eliminación de eritrocitos de la sangre10,12,46. Por lo tanto, los medicamentos que brindan actividades de rigidez pueden bloquear la transmisión de la malaria al hacer que las formas transmisibles no estén disponibles para el mosquito vector Anopheles que se alimenta de sangre9,10. La etapa de gametocito es un estrecho cuello de botella en el ciclo del parásito hacia la transmisión a los mosquitos8. Bloquear esa transmisión ya es un componente importante del esfuerzo de erradicación de la malaria7 y puede adquirir aún más importancia para abordar la reciente aparición de mosquitos resistentes a los insecticidas47, parásitos resistentes a la artemisinina6 y el reciente aumento en la incidencia mundial de la malaria1. Nuestro exitoso enfoque enriquece la lista de compuestos anti-gametocitos. Identificamos compuestos, objetivos y, potencialmente, un fármaco antigametocitos que no se habría capturado con un enfoque basado en la matanza. Tanto los excelentes perfiles de seguridad de NITD609 y TD-6450 como la relevancia fisiológica de su efecto de eliminación de gametocitos exigen su rápida evaluación en humanos en esta indicación. Debido a que la filtración de eritrocitos miméticos del bazo ha sido validada contra bazos humanos perfundidos ex vivo48, se espera que NITD609 y TD-6450 reduzcan realmente las concentraciones de gametocitos en la circulación de sujetos humanos.

Anteriormente, las propiedades mecánicas de los gametocitos maduros solo se habían explorado a pequeña escala13,16 y adaptar la filtración de eritrocitos a través de capas de microesferas ("microfiltración")25 a la detección de alto rendimiento para los endurecedores de gametocitos ha sido un desafío técnico. Sin embargo, el esfuerzo es merecido, ya que la microfiltración puede analizar simultáneamente de cientos28 a miles de muestras27. La combinación optimizada de producción de gametocitos a gran escala, microfiltración en placas de 384 pocillos e imágenes de alto contenido eventualmente condujo a un ensayo sólido: la campaña de detección capturó fármacos con efectos conocidos para matar gametocitos, como azul de metileno, inhibidores de Pf-ATPasa 4, e inhibidores de Pf-PI4K, lo que confirma la precisión del proceso de selección de aciertos. De hecho, las campañas de detección anteriores habían identificado el azul de metileno31,33,34 y los inhibidores de la ATPasa 4 (NITD609 y PA92), EF2 (DDD49849) y PI4K, (MMV390048)50 como candidatos para bloquear la transmisión de la malaria. Varios grupos ya habían examinado la biblioteca Pathogen Box29,30,31 y nuestro trabajo confirma los efectos de tres fármacos, a saber, MMV020081, MMV667494 y MMV030734. Los dos últimos endurecieron específicamente los gametocitos femeninos en nuestro estudio, lo que confirma que es frecuente un efecto de sesgo de género de los compuestos anti-gametocitos18. Identificamos un grupo de 9 inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) que están en desarrollo clínico para el cáncer y candidatos prometedores para otras enfermedades, incluida la malaria sintomática51, lo que proporciona más evidencia de que la vía HDAC está involucrada en la transmisión de la malaria52. Sin embargo, no exploramos más esta familia de compuestos porque después de un análisis exhaustivo de su seguridad, encontramos que era aceptable para tratar el cáncer o la malaria sintomática potencialmente grave, pero probablemente no para las intervenciones de bloqueo de la transmisión de la malaria53,54. Futuras optimizaciones pueden identificar inhibidores de HDAC más selectivos para P. falciparum y con un mejor perfil de seguridad55. Es importante destacar que también encontramos varios mecanismos farmacológicos potenciales o dianas moleculares. Entre los éxitos, hubo nueve compuestos con actividades de rigidez únicamente, específicamente siete glucósidos cardíacos humanos que se dirigen a la bomba ATPasa y oligomicinas A y B, antibióticos que afectan la fosforilación oxidativa a través de la inhibición de la ATP sintasa. Es probable que nuestros hallazgos revelen nuevas vías moleculares involucradas en la biomecánica de los gametocitos. No menos importante, la gramicidina, un antibiótico formador de poros que crea fugas en las membranas bacterianas, fue nuestro asesino de gametocitos más poderoso, con un IC50 en el rango nanomolar bajo.

Centramos las exploraciones posteriores a la selección en el potencial de bloqueo de la transmisión de dos fármacos: NITD609 y TD-6450. NITD609 (también conocido como cipargamin) es un inhibidor de la ATPasa 4 con actividad contra todas las etapas de P. falciparum. Otro inhibidor de la ATPasa 4, PA92, fue capturado por la campaña de detección, lo que confirma que estos inhibidores son objetivos prometedores para las estrategias de bloqueo de la transmisión54. TD-6450, un inhibidor de la proteína no estructural 5A (NS5A), se probó en ensayos clínicos de fase II para el tratamiento de la hepatitis C. Nuestra campaña de detección reveló su efecto antipalúdico a través de la rigidez de los gametocitos maduros. El hecho de que TD-6450 inhiba el crecimiento del parásito en concentraciones de rango micromolar sugiere que su acción es predominantemente específica del parásito en lugar de basarse en un efecto putativo sobre los glóbulos rojos no infectados. De hecho, los glóbulos rojos no infectados no se vieron afectados (o solo levemente) por la exposición a TD6450 o NITD609 in vitro (Fig. S5). Los inhibidores de la proteína 5A no estructural en general, y el TD-6450 en particular, se administran por vía oral y son seguros en sujetos humanos (Tabla S3)55,56,57. Ledipasvir, un fármaco que muestra una alta homología con TD-6450, se puede administrar de forma segura a mujeres embarazadas58. De los 14 inhibidores de NS5A incluidos en la biblioteca ReFrame, solo TD-6450 cumplió con la definición de éxito. TD-6450 es el único inhibidor heterodimérico de NS5A que puede explicar su actividad mejorada. Sin embargo, no se puede excluir un efecto de clase en esta etapa. Las tasas máximas de retención de gametocitos observadas con TD-6450 fueron más bajas que las de NITD609, lo que recuerda a un antagonismo parcial. Las poblaciones de gametocitos contienen machos y hembras y se ha descrito un efecto de sesgo de género con fármacos antigametocitos59. Las diferencias de eficacia dependientes de la lectura observadas con TD-6450 en nuestro estudio pueden explicar la actividad aparentemente parcial, que por lo tanto puede ser completa en los machos y débil o ausente en las hembras. Se requiere una confirmación sólida de este punto.

A pesar de la IC50 relativamente alta observada in vitro, es probable que exista una ventana terapéutica para TD-6450. Los datos del modelo predicen que casi el 90 % de una población estará expuesta a concentraciones plasmáticas del fármaco que se espera que reduzcan la densidad de los gametocitos circulantes. Los tres principales determinantes de la transmisión de la malaria son la concentración de gametocitos en sangre periférica (gametocitemia), su secuestro potencial en la piel humana y el compromiso sexual durante el ciclo de multiplicación. De ellos, solo la gametocitemia se correlaciona sólidamente con la transmisión60,61,62,63. En un estudio reciente60, ninguno o muy pocos Anopheles se infectaron con sangre que contenía 30 o menos gametocitos/µl, y el número de Anopheles infectados fue al menos 10 veces menor con 50 gametocitos/µl que con 200–250 gametocitos/µl. Por lo tanto, un fármaco o una combinación de fármacos que induce la eliminación de 70 a 80% de los gametocitos puede afectar la transmisión, independientemente de su efecto sobre la viabilidad del parásito; incluso vivo, un gametocito endurecido retenido en el bazo es de hecho inaccesible a la picadura del mosquito. Se espera que la larga vida media de TD-6450 y la persistencia de su actividad después de la eliminación de la presión del fármaco faciliten un efecto sostenido de bloqueo de la transmisión.

En ausencia de un modelo animal validado para la retención esplénica de gametocitos maduros de P. falciparum48, el siguiente paso es un estudio en humanos. En un reciente estudio de desafío en humanos, se observó una circulación sostenida de gametocitos maduros después del tratamiento de voluntarios con piperaquina. Ese resultado abre el camino hacia una evaluación rápida y poderosa del potencial de bloqueo de la transmisión de medicamentos antiguos o nuevos64. Para medicamentos como los identificados aquí, potencialmente capaces de bloquear la transmisión al inducir la eliminación de gametocitos esplénicos, la lectura para tal evaluación sería la medida simple de gametocitemia luego de la administración del medicamento. La información preclínica muy importante para el desarrollo de fármacos antigametocíticos, como los ensayos de alimentación de membrana estándar y los estudios en ratones, son requisitos previos prescindibles en el contexto específico de nuestro enfoque. De hecho, una disminución en la gametocitemia está directamente relacionada con una transmisión reducida, y proporcionamos resultados sólidos que sugieren que TD-6450 y NITD609 pueden reducir la gametocitemia. El desarrollo de medicamentos para bloquear la transmisión de la malaria enfrenta desafíos éticos, farmacéuticos y logísticos. Si el efecto potencial de bloqueo de la transmisión de NITD609 y TD-6450 se confirma en un ensayo clínico, agregar estos medicamentos seguros al arsenal puede contribuir al impulso de un enfoque original que apunta a un control sostenido de la malaria.

La biblioteca Pathogen Box (400 compuestos, proporcionada por MMV-Medicine for Malaria Ventures, Ginebra, Suiza), la biblioteca Kinase Inhibitors Box (350 compuestos, proporcionada por GSK-Glaxo SmithKline DDW Unit, Tres Cantos, España) y la biblioteca ReFrame (12.805 compuestos proporcionados por el Instituto de California para la Investigación Biomédica-Calibr, La Jolla, CA, EE. UU.) se usaron de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Los compuestos solubilizados con DMSO (concentración de stock 10 mM) se cargaron en placas de 384 pocillos (Seahorse, nº de catálogo 201035-100). Se dejaron dos columnas vacías para los controles. Para cada compuesto, se colocaron previamente 5 nL en un solo pocillo para alcanzar una concentración final de 1,11 μM. El volumen final de cada pocillo fue de 45 μl. Los controles se prepararon de la siguiente manera: se cargaron 22,5 nl de DMSO en 16 pocillos como controles negativos (0,05 % de concentración final); Se cargaron 22,5 nL de NITD609 (proporcionado por MMV, Ginebra, Suiza) 1 mM en 8 pozos (concentración final de 0,5 μM), 17 nL de Calyculin A (Sigma, cat. no. C5552) 0,2 μM se cargaron en 6 pozos (75 concentración final nM) y 225 nL de violeta de genciana (MolPort, nº de cat. 002-133-551) 10 mM se cargaron en los 2 pocillos restantes (concentración final 50 μM). Las placas se prepararon por triplicado para la caja de patógenos y por sextuplicado para la caja de inhibidores de cinasa.

Se cultivaron parásitos de la cepa Plasmodium falciparum NF54 (utilizados para la campaña de detección) con un hematocrito del 4 % en glóbulos rojos de donantes de sangre informados (grupo sanguíneo A) como se describió anteriormente65. Los parásitos se tomaron del congelador a -80 °C, luego se fundieron rápidamente durante 1 minuto en un baño de agua a 37 °C. Se añadió suavemente una solución salina para evitar la lisis. Primero se disuelve NaCl al 12% en agua destilada (1/5 del volumen medido en el criovial) y luego se disuelve NaCl al 1,6% (9 veces el volumen del criovial). Después de eso, se agregaron glóbulos rojos frescos para permitir que los parásitos volvieran a crecer. Los glóbulos rojos infectados se mantuvieron en medio RPMI (Sigma-Aldrich, nº de catálogo R4130), suplementado con suero humano descomplementado al 10 %, 50 mg/l de hipoxantina (Sigma-Aldrich, nº de catálogo H9636). Biobanco de Castilla y León y Centro de Transfusiones de Madrid como proveedores de concentrados de glóbulos rojos humanos. La producción de gametocitos se indujo a partir de una parasitemia en anillo al 0,5% (día 0). El medio se cambió diariamente para inducir la diferenciación de los gametocitos, como se describió previamente66. El día 17, los gametocitos se concentraron usando un medio de gradiente de densidad (NycoPrep 1.077, Progen cat. no. 1114550)27. La parasitemia se ajustó mediante FACS (tinción doble SYBR-Green y MitoTracker, objetivo del 3 al 5 %). El hematocrito se ajustó al 0,5 % añadiendo glóbulos rojos frescos y se controló mediante recuento manual en una cámara de Neubauer (Celeromics, nº de catálogo 717810). Finalmente, la suspensión de gametocitos se vertió (45 μL/pocillo) en la microplaca de 384 pocillos que contenía el compuesto, luego se incubó 24 horas tanto para la campaña de detección como para el análisis de dosis-respuesta. Tanto los estadios asexuales como los sexuales se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM, hipoxantina 50 mg/ml, gentamicina 50 µg/ml, suero humano combinado inactivado por calor al 10% (A+). Cada lote de suero se obtuvo agrupando 10 bolsas de suero de diferentes donantes. El suero se mantuvo a -20 °C y se descongeló en un baño de agua caliente antes de su uso. Se preparó un nuevo lote de suero cuando se completó el anterior. Para el análisis de dosis-respuesta y la microfluídica, se probaron tanto la cepa 3D7-pULG8-GFP67 como la NF54 (BEI Resources, nº de catálogo MRA-1000). La cepa 3D7 se cultivó como se describe anteriormente con la adición de NaHCO3 al 0,2 % y WR99210 2,5 nM para las etapas asexual y sexual.

La microfiltración a gran escala se realizó como se describió previamente27. Brevemente, las placas de microfiltración se prepararon utilizando una estación de trabajo Biomek NX (Beckman, n.º de cat. 989402) para cargar 15 μl de microesferas de 25–45 μm y luego 10 μl de una mezcla de 30 % 5–15 μm y 70 % (p/p) 15 –Microesferas de 25 μm. A continuación, las placas de filtración de 384 pocillos se almacenaron a -20 °C hasta su uso. En algunas de las placas de microfiltración de 384 pocillos se produjeron fugas de microesferas en uno o más pocillos. Los pozos con fugas fueron sellados. No se utilizaron placas que presentaban más de 5 pocillos sellados. Las placas de imágenes se prepararon cargando 30 μL de solución de tinción en cada pocillo de una placa recubierta de colágeno. Se utilizó una solución de tinción diferente para cada lectura (1 y 2). La lectura 1 contó tanto los gametocitos masculinos como los femeninos, mediante tinción de ácido nucleico (Syto40, Thermo Fisher, n.º de cat. S11351) y viabilidad (MitoTracker Deep Red, Thermo Fisher, n.º de cat. M22426), y el total de glóbulos rojos mediante una tinción de membrana celular (CellMask naranja, Thermo Fisher n.º de catálogo C10045). La lectura 2 cuantificó selectivamente la retención y destrucción de gametocitos femeninos. Un marcador de gameto femenino específico (anti-pfs25, clon 4B7, BEI Resources cat. no. MRA-315), acoplado anteriormente con colorante fluorescente Cy3 (GE Healthcare, cat. no. PA33000), se disolvió en medio de ookinete (medio RPMI con HEPES 25 mM, hipoxantina 50 mg/litro, bicarbonato de sodio 2 g/litro, ácido xanturénico 100 μM, suero humano al 20 %) para inducir la activación de los gametos femeninos18. También se añadió una tinción de membrana celular diferente (CallMask Deep Red, Thermo Fisher n.º de catálogo C10046) para contar todos los glóbulos rojos. Se realizó un protocolo de microfiltración automatizado utilizando la estación de trabajo Biomek NX (Beckman, nº de cat. 989402) conectada a una bomba de vacío. La microfiltración automatizada se realizó como se describió previamente27. Las placas de imágenes se incubaron durante la noche a temperatura ambiente, luego se leyeron en un sistema de imágenes confocales de alto contenido OperaPhenix (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.) y se analizaron con el software de análisis de alto contenido Harmony v. 5.0.

A partir del análisis de las placas de imágenes, se calculó el porcentaje de infección de gametocitos en función del número de gametocitos dividido por el número de células totales. Esto se hizo para muestras aguas arriba (UP) y aguas abajo (DS). La matanza se calculó utilizando la siguiente fórmula:

La tasa de retención se calculó como se describió previamente25 con la siguiente fórmula:

Luego se graficaron las tasas de muerte (eje x) y retención (eje y). Se calculó una línea de regresión con una banda de predicción del 95 % utilizando el software GraphPad Prism 5.1. Los valores atípicos se excluyeron del cálculo de regresión lineal. Solo aquellos compuestos que quedaron fuera de la banda de predicción superior en ambas lecturas fueron finalmente seleccionados como aciertos. Los análisis se realizaron placa por placa. Para cada placa de tamizado individual, el parámetro Z' se calculó como se describió anteriormente68 con la siguiente fórmula:

donde RR es el promedio de la tasa de retención, SD la desviación estándar, PC el control positivo (NITD609 0.5 μM) y NC el control negativo (DMSO 0.05%).

Con respecto al análisis estadístico de los experimentos posteriores a la selección, se realizó preliminarmente una prueba ANOVA ordinaria de una vía para validarlo, cuando el valor de P de dos colas fue inferior a 0,001. El ANOVA fue seguido por una prueba t pareada para calcular los valores P de dos colas de las diferencias individuales (mostrados con asteriscos en las figuras).

Se realizaron análisis de dosis-respuesta (DRA) para determinar el efecto de destrucción y la actividad de refuerzo para cada golpe seleccionado como se definió anteriormente. Los resultados de OperaPhenix se graficaron con el eje x que representa la concentración del compuesto y el eje y la tasa de destrucción o retención. Usando el software GraphPad 5.1 Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), los resultados se transformaron en forma logarítmica y se rastreó una curva de log (agonista) frente a respuesta (pendiente variable). El software calculó la concentración a la que se inhibe el 50 % de la destrucción o la retención (IC50) a partir de la ecuación de la curva:

donde B es el valor inferior, T es el valor superior y ɣ es la pendiente.

Tanto los análisis de dosis fija como los de dosis-respuesta se realizaron de acuerdo con un segundo protocolo (laboratorio de París) para validar los resultados seleccionados del cribado primario. Brevemente, la suspensión de gametocitos se cargó en una placa vacía de 96 pocillos (200 µl/pocillo). Para cada dosis-respuesta, en primer lugar, se duplicó el volumen del pocillo y se añadió el compuesto para obtener una concentración final de 10 µM. Para el análisis de dosis-respuesta, la suspensión de gametocitos se diluyó entonces manualmente en serie 1/2 para 12 puntos, obteniendo 5 nM como la concentración más baja. Se hizo la misma operación con DMSO para tener un control negativo. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, las suspensiones de gametocitos se cargaron en una placa de filtración de 96 pocillos28 y la microfiltración se realizó manualmente a 37 °C. Las muestras aguas arriba y aguas abajo se incubaron durante 30 min con tinción nuclear Hoechst 33342 (diluido 1/1000 en PBS, Thermo Fischer cat. no. H3570), se lavaron, se resuspendieron en 200 µL de PBS y luego se cargaron en una placa de 96 pocillos vacía antes Cuantificación FACSCanto (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, EE. UU.). Los datos de citofluorimetría se analizaron con FlowJo V12. Según las experiencias descritas anteriormente con esta técnica, para evitar el riesgo de saturación de las capas de microesferas, se repitió un experimento de microfiltración cuando la gametocitemia aguas arriba superó el 10%25,69.

Se realizó citometría de flujo de imágenes usando ImageStream X Mark II (Amnis parte de Luminex) para determinar la relación de aspecto de los eritrocitos infectados por un gametocito maduro de P. falciparum usando imágenes de campo claro (aumento de 60x) procesadas con software de computadora (IDEAS v 6.2, AMNIS ). La relación de aspecto es la relación entre el eje menor dividido por el eje mayor y describe qué tan redondo u oblongo es un objeto. Se seleccionaron celdas enfocadas y celdas individuales para analizar la función de relación de aspecto para documentar la forma de las celdas.

Las cepas de Plasmodium falciparum 3D7-pULG8-GFP o NF54 se sincronizaron mediante sorbitol lysis70. A continuación, los anillos se diluyeron al 0,5 % de parasitemia y se cargaron en una placa vacía de 96 pocillos (200 µl/pocillo). En primer lugar, se duplicó el volumen del pocillo y se añadió el compuesto para obtener concentraciones finales de 20 µM (TD-6450) y 500 nM (NITD609). A continuación, la suspensión del anillo se diluyó manualmente en serie 1/2 para 12 puntos, obteniendo 9,77 nM (TD-6450) y 0,24 nM (NITD609) como concentraciones más bajas. Se hizo la misma operación con DMSO para tener un control negativo. Después de 48 horas de incubación, las placas se centrifugaron y los gránulos de RBC se incubaron durante 30 min con Sybr-G (1/1000 diluido en PBS, Thermo Fisher, n.º de catálogo S7567). Después del lavado con PBS (2x), los sedimentos se resuspendieron en 200 µl de PBS y la parasitemia se cuantificó mediante FACSCanto y se analizó con FlowJo V12. Los IC50 se determinaron usando GraphPad Prism 5.1 como se mencionó. Las imágenes de microscopía óptica se tomaron con un microscopio invertido Leica y se analizaron con el software Las X.

Este fue un estudio de fase I, doble ciego, aleatorizado, controlado con placebo, de dosis única ascendente (SAD) y de dosis múltiple ascendente (MAD) para evaluar la seguridad y tolerabilidad de TD-6450 en sujetos sanos (objetivo principal) y la farmacocinética (objetivo secundario). El estudio está disponible en el sitio web clinictrial.gov (identificador NCT02022306), comenzó el 4 de febrero de 2014 (primer sujeto inscrito) y finalizó el 18 de agosto de 2014 (último sujeto concluido), en Healthcare Discoveries (subsidiaria de ICON Soluciones de Desarrollo) en San Antonio, Texas, EE.UU. Se seleccionaron para este estudio sujetos sanos, no fumadores, sin antecedentes de condiciones médicas significativas, con un IMC comprendido entre 18 y 30 kg/m2, que pesaran al menos 50 kg, entre 18 y 60 años. Los sujetos podían y estaban dispuestos a dar un consentimiento informado. No se informó sesgo en el proceso de selección. El protocolo y todas las enmiendas para este estudio y todo el material adjunto que se proporcionó a los sujetos (incluidos los anuncios, las hojas de información del sujeto y las descripciones del estudio utilizadas para obtener el consentimiento informado) fueron presentados por el investigador a la Junta de Revisión Institucional (IRB) centralizada. , a saber, IntegReview, establecido en 1999 en Austin (Texas, EE. UU.) y adquirido por Advarra en 2020. Se obtuvo la aprobación documentada antes de que se iniciara el estudio, el 28 de marzo de 2014. Este estudio se realizó de acuerdo con el protocolo, los principios de la Conferencia Internacional sobre la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano (ICH), la Guía de Buenas Prácticas Clínicas (GCP), el Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos, los principios de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, los Principios Éticos para Investigación médica con seres humanos y todos los requisitos reglamentarios aplicables.

Los resultados primarios y secundarios se predefinieron de la siguiente manera: seguridad y tolerabilidad como resultado primario, farmacocinética como resultado secundario. La seguridad y la tolerabilidad se evaluaron utilizando medidas estándar, incluida la monitorización de eventos adversos (EA), pruebas de laboratorio clínico (hematología, química sérica, coagulación y análisis de orina), signos vitales, exámenes físicos y electrocardiogramas (ECG) de 12 derivaciones. Los eventos adversos fueron evaluados por el investigador y definidos como cualquier evento médico adverso en un paciente o sujeto de investigación clínica al que se le administró un producto farmacéutico y que no necesariamente tuvo una relación causal con este tratamiento. La farmacocinética se evaluó mediante la recolección de muestras de sangre de cada sujeto en los siguientes puntos de tiempo: predosis (dentro de los 30 min antes de la dosificación, solo en el día 1 60 min antes de la dosificación), y 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 12 horas después de la dosificación. Se analizaron muestras de sangre para calcular los siguientes parámetros farmacocinéticos: AUC0-24: área bajo la curva de concentración plasmática versus tiempo, desde el tiempo cero hasta 24 horas después de la infusión, AUC0-t: área bajo la curva de concentración plasmática versus tiempo, desde el tiempo cero hasta 24 horas después de la infusión. la última muestra con concentración de analito cuantificable, AUC0-∞: área bajo la curva de concentración plasmática frente al tiempo, desde el tiempo cero hasta el infinito, Cmax: concentración plasmática máxima, Tmax: tiempo para alcanzar la Cmax, semivida de eliminación terminal (t1/2) , CL/F: aclaramiento plasmático oral, Vz/F: volumen aparente de distribución durante la fase terminal, Ae (cantidad excretada en la orina): la cantidad acumulada excretada en la orina desde el momento cero hasta la última muestra con concentración medible del analito, Fe: fracción de la dosis excretada en la orina (TD-6450 solamente) (Día 1 y 14 MAD solamente), CLr: aclaramiento renal.

Este estudio se realizó en dos partes, Parte A (SAD) y Parte B (MAD). Para la Parte A, la edad de los sujetos inscritos varió de 20 a 60 años, con un rango de edad promedio de 32,1 a 46,2 años. La mayoría de los sujetos eran hombres (73 sujetos en total) y la mayoría eran blancos (55 sujetos) o negros (22 sujetos). Para la Parte B del estudio, las edades oscilaron entre 23 y 60 años, con una edad media similar en todos los grupos de tratamiento. La mayoría de los sujetos eran hombres (25 sujetos en total) y todos eran blancos (18 sujetos) o negros (12 sujetos). Para cada parte del estudio, el índice de masa corporal (IMC) medio y la depuración de creatinina fueron similares en todos los grupos de tratamiento. Ningún sujeto tenía un historial médico clínicamente significativo de relevancia. Parte A: los sujetos sanos se inscribieron secuencialmente y se asignaron al azar a cada cohorte de dosis (se planificaron hasta 10 cohortes de dosis ascendente, incluido un brazo alimentado en la cohorte del efecto de los alimentos) para recibir una dosis única de TD-6450 o un placebo. Para cada cohorte de dosis, se aleatorizaron 8 sujetos en una proporción de 3:1 (6 sujetos recibieron TD-6450 y 2 sujetos recibieron placebo). La dosis inicial de TD-6450 fue de 0,5 mg con una dosis máxima planificada de 1000 mg. Tras la revisión de los datos farmacocinéticos de la cohorte de 500 mg, se tomó la decisión de no escalar a la cohorte de 1000 mg debido a la saturación de la exposición a ≥ 500 mg. Se administraron las siguientes dosis: 0,5 mg, 1,5 mg, 5 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg, 240 mg y 500 mg. Parte B: los sujetos sanos se inscribieron secuencialmente en 3 cohortes de dosis ascendentes (TD-6450 60 mg, 120 mg y 240 mg) y se asignaron al azar para recibir TD-6450 o placebo como dosis una vez al día durante 14 días. Para cada cohorte de dosis, se aleatorizaron 10 sujetos en una proporción de 4:1 (8 sujetos recibieron TD-6450 y 2 sujetos recibieron placebo). El Comité de revisión de datos de seguridad (SDRC, por sus siglas en inglés) revisó los datos cegados de seguridad, tolerabilidad y farmacocinética disponibles después de cada cohorte de dosis antes de escalar a la siguiente cohorte de dosificación para las partes A y B. Los sujetos del estudio clínico se asignaron aleatoriamente a cada cohorte. Se asignaron códigos de aleatorización a los sujetos. Todos los sujetos del estudio, los investigadores del estudio y el personal del patrocinador involucrado en la realización del estudio desconocían la asignación del tratamiento. El único personal que tuvo acceso al código de aleatorización antes del bloqueo de la base de datos fue: El farmacéutico o miembro del personal de farmacia que preparó las cápsulas del fármaco o el placebo para administrarlas al sujeto de acuerdo con el código de aleatorización y el laboratorio bioanalítico contratado que analizó las muestras farmacocinéticas (plasma y orina).

El fármaco del estudio de cada sujeto se etiquetó adecuadamente para facilitar la correcta administración al sujeto asignado. Toda la documentación relacionada con la asignación del tratamiento de los sujetos (es decir, códigos de aleatorización, registros de responsabilidad de medicamentos) se mantuvo en un área segura para que solo el personal de farmacia no cegado tuviera acceso a ellos, y estas personas no estuvieran involucradas en ningún aspecto del manejo de sujetos, formulario de informe de caso (CRF) entrada, monitoreo o informe requerido por el protocolo, que no sea para registros de dispensación. En el caso de una emergencia médica o de un desenmascaramiento con fines de aumento de la dosis, la identidad del fármaco del estudio se habría desenmascarado en el sitio clínico. Si surgiera una emergencia médica, el código de aleatorización para un sujeto individual se habría descifrado utilizando un conjunto de códigos de emergencia sellados proporcionados al farmacéutico o al miembro del personal autorizado.

Debido a la naturaleza exploratoria de este estudio, no se utilizaron cálculos formales de potencia o tamaño de la muestra para determinar el tamaño de la cohorte. Un tamaño de muestra de 88 sujetos sanos (8 sujetos por cohorte) para el estudio SAD y un tamaño de muestra de 30 sujetos sanos (10 por cohorte) para el estudio MAD deberían proporcionar una caracterización adecuada de PK y evaluaciones de seguridad dentro de este entorno. En el momento de la selección, los sujetos elegibles tenían entre 18 y 60 años de edad (inclusive), tenían un índice de masa corporal de 18 a 30 kg/m2 (inclusive), pesaban al menos 50 kg y gozaban de buena salud a juzgar por la ausencia de síntomas clínicamente significativos. enfermedades o valores de laboratorio anormales clínicamente significativos (detección o día −1). El estudio se realizó en Healthcare Discoveries (una subsidiaria de ICON Development Solutions) en San Antonio, Texas, EE. UU.

Los datos se combinaron de dos estudios con voluntarios sanos, uno de dosis única ascendente (SAD) y el otro de dosis múltiple ascendente (MAD). Los datos de concentración observados se transformaron en sus logaritmos naturales y se evaluaron utilizando modelos de efectos mixtos no lineales en NONMEM v7.4 (Icon Development Solution, Ellicott City, MD). Pirana v3.0, Perl-speaks-NONMEM (PsN) v4.8.1 y Xpose versión 4.7.1 se utilizaron para la automatización, la evaluación del modelo y el diagnóstico durante el proceso de creación del modelo.

Se evaluaron diferentes modelos de distribución estructural (modelos de 1, 2 y 3 compartimentos), así como diferentes modelos de absorción (modelos de absorción de primer orden y de compartimento de tránsito (n = 1–10)). Se fijó la biodisponibilidad relativa a la unidad para la población para evaluar la variabilidad interindividual y la influencia de las covariables en un mismo parámetro. El peso corporal se evaluó como una función alométrica fija (exponente de 0,75 para los parámetros de depuración y 1,0 para los parámetros de volumen), centrada en un paciente típico que pesaba 80 kg. Otras relaciones covariables-parámetros biológicamente plausibles (es decir, sexo y edad en todos los parámetros, cantidad de la dosis y duración del tratamiento en el aclaramiento de eliminación, tasa de absorción y biodisponibilidad relativa, ingesta concomitante de alimentos en la tasa de absorción y biodisponibilidad relativa, y aclaramiento de creatinina en el aclaramiento de eliminación) fueron evaluado con un enfoque de adición paso a paso (p < 0,05) y eliminación (p < 0,001). Todas las covariables significativas en el paso hacia adelante se evaluaron con funciones tanto lineales como no lineales, y el modelo de mejor rendimiento se retuvo para el paso de eliminación hacia atrás. Se asumió que los parámetros farmacocinéticos tenían una distribución logarítmica normal, y la variabilidad interindividual (IIV) y la variabilidad entre ocasiones (IOV) se implementaron como funciones exponenciales. La IIV estimada por debajo del 10% se eliminó en el modelo final y la IOV se estimó solo en los parámetros de absorción.

El ajuste del modelo se evaluó principalmente mediante el valor de la función objetivo (OFV; calculado por NONMEM como proporcional a −2 × log-verosimilitud de los datos). La discriminación de modelos entre dos modelos jerárquicos se determinó mediante una prueba de razón de verosimilitud, basada en la distribución Chi-cuadrado de OFV (es decir, valor p < 0,05 correspondiente a ΔOFV > 3,84, con una diferencia de 1 grado de libertad). Se utilizó la bondad de ajuste para evaluar el desempeño descriptivo de los modelos desarrollados. Se utilizaron comprobaciones predictivas visuales corregidas por predicción y variabilidad (pvcVPC, n = 2000 simulaciones) para evaluar el rendimiento predictivo de los modelos desarrollados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este documento están presentes en el manuscrito principal o en los Materiales complementarios. Los resultados de la pantalla in vitro primaria de la biblioteca ReFrame generada en este estudio se han depositado en la base de datos Reframe (https://reframedb.org/assays/A00279) con el código de acceso A00279. El estudio clínico de Fase I (ID: NCT02022306) descrito en este documento está depositado en la base de datosclinicaltrials.gov (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=NCT02022306&cntry=&state=&city=&dist=) bajo el código de acceso NCT02022306. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

OMS. Informe mundial sobre el paludismo 2021. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2021 (2021).

Ashley, EA et al. Propagación de la resistencia a la artemisinina en la malaria por Plasmodium falciparum. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1314981 (2014).

Menard, D. et al. Un mapa mundial de polimorfismos de hélice K13 de Plasmodium falciparum. N.Ingl. J.Med. 374, 2453–2464 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Noedl, H., Socheat, D. & Satimai, W. Paludismo resistente a la artemisinina en Asia. N. ingl. J.Med. 361, 540–541 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Balikagala, B. et al. Evidencia de malaria resistente a la artemisinina en África. N. ingl. J.Med. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2101746 (2021).

White, NJ Aparición de olasmodium falciparum resistentes a la artemisinina en África Oriental. N. ingl. J.Med. https://doi.org/10.1056/NEJMe2110659 (2021).

Burrows, JN et al. Nuevos desarrollos en perfiles de productos y candidatos objetivo contra la malaria. Malar. J. 16, 26 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sinden, RE Diferenciación de Plasmodium en el mosquito. Parasitologia 41, 139–148 (1999).

CAS PubMed Google Académico

Mohandas, N., Rossi, ME & Clark, MR Asociación entre la distorsión morfológica de las células falciformes y el aumento de la permeabilidad catiónica inducida por la desoxigenación. Sangre 68, 450–454 (1986).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Safeukui, I. et al. Retención de eritrocitos infectados con anillo de Plasmodium falciparum en la microcirculación abierta y lenta del bazo humano. Sangre 112, 2520–2528 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Groom, AC, Schmidt, EE & MacDonald, IC Vías microcirculatorias y flujo sanguíneo en el bazo: nuevos conocimientos de la cinética de lavado, moldes de corrosión y videomicroscopía intravital cuantitativa. Microscopía de barrido. 5, 159–173 (1991).

CAS PubMed Google Académico

Safeukui, I. et al. Evaluación cuantitativa de la detección y secuestro de eritrocitos esferocitarios por el bazo humano. Sangre 120, 424–430 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aingaran, M. et al. La deformabilidad de la célula huésped está relacionada con la transmisión en el parásito de la malaria humana Plasmodium falciparum. Celúla. Microbiol. 14, 983–993 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cranston, HA et al. La maduración de Plasmodium falciparum suprime la deformabilidad fisiológica de los glóbulos rojos. Ciencia 223, 400–403 (1984).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Miller, LH, Usami, S. & Chien, S. Alteración en las propiedades reológicas de los glóbulos rojos infectados con Plasmodium knowlesi. Un posible mecanismo para la obstrucción capilar. J. Clin. Invertir. 50, 1451-1455 (1971).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tiburcio, M. et al. Un cambio en la deformabilidad de los eritrocitos infectados en la maduración y circulación sanguínea de las etapas de transmisión de Plasmodium falciparum. Sangre 119, e172–e180 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Almela, MJ et al. Un nuevo conjunto de puntos de partida químicos con el potencial de bloqueo de la transmisión de Plasmodium falciparum para el descubrimiento de fármacos antipalúdicos. PLoS One 10, e0135139 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Delves, MJ et al. Una pantalla de alto rendimiento para pistas de próxima generación dirigidas a la transmisión del parásito de la malaria. Nat. común 9, 3805 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lucantoni, L. et al. Un ensayo de imágenes de alto contenido fenotípico simple y predictivo para gametocitos maduros de Plasmodium falciparum para identificar compuestos que bloquean la transmisión de la malaria. ciencia Rep. 5, 16414 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plouffe, DM et al. Ensayo de alto rendimiento y descubrimiento de pequeñas moléculas que interrumpen la transmisión de la malaria. Microbio huésped celular 19, 114–126 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potluri, V. et al. Descubrimiento de FNDR-20123, un inhibidor de histona desacetilasa para el tratamiento de la malaria por Plasmodium falciparum. Malar. J. 19, 365 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paonessa, G. et al. Quimiotipos bloqueadores de la transmisión específicos de gametocitos y en todas las etapas de la sangre descubiertos a partir de un cribado de alto rendimiento en gametocitos de Plasmodium falciparum. común Biol. 5, 1–10 (2022).

Artículo Google Académico

Janes, J. et al. La biblioteca ReFRAME como una biblioteca integral de reutilización de fármacos y su aplicación al tratamiento de la criptosporidiosis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, 10750–10755 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lotario, J. et al. Reposicionamiento: ¿la vía rápida hacia nuevos medicamentos contra la malaria? Malar. J. 13, 143 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Deplaine, G. et al. La detección de glóbulos rojos poco deformables por el bazo humano se puede imitar in vitro. Sangre 117, e88–e95 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Depond, M., Henry, B., Buffet, P. & Ndour, PA Métodos para investigar la deformabilidad de los glóbulos rojos durante la malaria. Frente. Fisiol. 10, 1613 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Duez, J. et al. Microfiltración de alto rendimiento para evaluar la deformabilidad de los glóbulos rojos y detectar fármacos que bloqueen la transmisión de la malaria. Nat. Protocolo 13, 1362–1376 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Duez, J. et al. Retención esplénica de gametocitos de Plasmodium falciparum para bloquear la transmisión de la malaria. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 59, 4206–4214 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calit, J. et al. Detección de la caja patógena en busca de moléculas activas contra las etapas sexuales de Plasmodium utilizando una nueva línea transgénica basada en nanoluciferasa de P. berghei Identifica compuestos que bloquean la transmisión. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 62, e01053–18 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dennis, ASM, Rosling, JEO, Lehane, AM y Kirk, K. Diversos antipalúdicos de las pantallas fenotípicas de células completas interrumpen la homeostasis del volumen y los iones del parásito de la malaria. ciencia Rep. 8, 8795 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duffy, S. & Avery, VM Identificación de inhibidores del desarrollo de gametocitos de Plasmodium falciparum. Malar. J. 12, 408 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Naissant, B. et al. La fosforilación de Plasmodium falciparum STEVOR regula la deformabilidad de los eritrocitos del huésped que permite la transmisión del parásito de la malaria. Sangre 127, e42–e53 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

N'Dri, M.-E., Royer, L. & Lavazec, C. Tadalafil afecta las propiedades mecánicas de los eritrocitos infectados con gametocitos de Plasmodium falciparum. mol. Bioquímica Parasitol. 244, 111392 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Coulibaly, B. et al. Fuerte efecto gametocitocida de la terapia combinada a base de azul de metileno contra la malaria falciparum: un ensayo controlado aleatorizado. PLoS One 4, e5318 (2009).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

D'Alessandro, S. et al. Un ensayo de detección de Plasmodium falciparum para fármacos antigametocitos basado en la detección de parásitos con lactato deshidrogenasa. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 68, 2048–2058 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Miguel-Blanco, C. et al. Ensayo de detección de alto rendimiento basado en imágenes para identificar nuevas moléculas con potencial de bloqueo de la transmisión contra la formación de gametos femeninos de Plasmodium falciparum. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 59, 3298–3305 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCarthy, JS et al. Un estudio de fase 1, controlado con placebo, aleatorizado, de dosis única ascendente y un estudio de infección de voluntarios para caracterizar la seguridad, la farmacocinética y la actividad antipalúdica del inhibidor de la 4-quinasa de fosfatidilinositol de Plasmodium MMV390048. clin. Infectar. Dis. 71, e657–e664 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hien, TT et al. Estimación de la MIC in vivo de Cipargamin en malaria por Plasmodium falciparum no complicada. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 61, e01940–16 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rottmann, M. et al. Espiroindolonas, una clase de compuestos potentes para el tratamiento de la malaria. Ciencia 329, 1175–1180 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, R. et al. Una base para la eliminación rápida de parásitos de malaria en etapa anular circulantes por la espiroindolona KAE609. J. infectar. Dis. 213, 100–104 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Pelt-Koops, J. Cvan et al. El candidato a fármaco espiroindolona NITD609 inhibe potentemente la gametocitogénesis y bloquea la transmisión de Plasmodium falciparum al vector Mosquito anopheles. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 56, 3544–3548 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hassan, HE et al. Farmacocinética y evaluación de seguridad de l-tetrahidropalmatina en usuarios de cocaína: un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo. J. Clin. Farmacol. 57, 151–160 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Malebo, HM et al. Actividad antiprotozoaria de los alcaloides de aporfina y protoberberina de Annickia kummeriae (Engl. & Diels) Setten & Maas (Annonaceae). Complemento BMC. Alterno Medicina. 13, 48 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chavchich, M., Van Breda, K., Rowcliffe, K., Diagana, TT y Edstein, MD La espiroindolona KAE609 no induce etapas anulares latentes en parásitos Plasmodium falciparum. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 60, 5167–5174 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ménard, S. et al. Inducción de tolerancia a múltiples fármacos en Plasmodium falciparum por presión extendida de artemisinina. emergente Infectar. Dis. 21, 1733–1741 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Roussel, C. et al. La eliminación rápida de los microeritrocitos inducidos por el almacenamiento altera la recuperación de la transfusión. Sangre 137, 2285–2298 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jagannathan, P. & Kakuru, A. Malaria en 2022: desafíos crecientes, optimismo cauteloso. Nat. común 13, 2678 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buffet, PA y col. La perfusión ex vivo de bazos humanos mantiene las funciones de limpieza y procesamiento. Sangre 107, 3745–3752 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Baragaña, B. et al. Un nuevo agente antipalúdico de múltiples etapas que inhibe la síntesis de proteínas. Naturaleza 522, 315–320 (2015).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dechering, KJ et al. El modelado de la infección por mosquitos en densidades de parásitos naturales identifica fármacos dirigidos a EF2, PI4K o ATP4 como candidatos clave para interrumpir la transmisión de la malaria. ciencia Rep. 7, 17680 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buggy, JJ et al. CRA-024781: un nuevo inhibidor sintético de las enzimas histona desacetilasa con actividad antitumoral in vitro e in vivo. mol. Cáncer Ther. 5, 1309–1317 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bética, P. et al. Efectos histológicos de givinostat en niños con distrofia muscular de Duchenne. Neuromuscular. Desorden. 26, 643–649 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Kumar, A., Dhar, SK y Subbarao, N. Identificación in silico de inhibidores contra la histona desacetilasa 1 de Plasmodium falciparum (PfHDAC-1). J. Mol. Modelo. 24, 232 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Vaidya, AB et al. Los compuestos de pirazolamida son antipalúdicos potentes que atacan la homeostasis del Na+ en Plasmodium falciparum intraeritrocitario. Nat. común 5, 5521 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Garimella, T. et al. Efectos de una coformulación de dosis fija de Daclatasvir, Asunaprevir y Beclabuvir sobre la farmacocinética de un cóctel de citocromo P450 y sustratos transportadores de fármacos en sujetos sanos. Drogas RD 18, 55–65 (2018).

Artículo MathSciNet CAS Google Académico

Mogalian, E. et al. Farmacocinética preclínica y primera farmacocinética en humanos, seguridad y tolerabilidad de Velpatasvir, un inhibidor NS5A del virus de la hepatitis C pangenotípica, en sujetos sanos. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 61, e02084-16 (2017).

Li, C. et al. Farmacocinética, seguridad y tolerabilidad de Ledipasvir/Sofosbuvir y Sofosbuvir/Velpatasvir en sujetos chinos sanos. clin. El r. 42, 448–457 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chappell, CA et al. Ledipasvir más sofosbuvir en mujeres embarazadas con infección por el virus de la hepatitis C: un estudio farmacocinético de fase 1. Lancet Microbe 1, e200–e208 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Delves, MJ et al. Los gametocitos maduros masculinos y femeninos de Plasmodium falciparum muestran diferentes respuestas a los medicamentos antipalúdicos. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. https://doi.org/10.1128/AAC.00325-13 (2013).

Meibalan, E. et al. Densidad e infectividad de gametocitos de Plasmodium falciparum en sangre periférica y tejido cutáneo de portadores de parásitos naturalmente infectados en Burkina Faso. J. infectar. Dis. 223, 1822–1830 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lengeler, C. Mosquiteros y cortinas tratados con insecticida para la prevención de la malaria. Sistema de base de datos Cochrane. Rev. https://doi.org/10.1002/14651858.CD000363.pub2 (2004).

Zavala, F. RTS,S: la primera vacuna contra la malaria. J. Clin. Invertir. 132, e156588 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sinden, RE Desarrollo de estrategias de bloqueo de la transmisión para el control de la malaria. Patog de PLoS. 13, e1006336 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Piedra, W. et al. Tafenoquina de dosis baja única combinada con dihidroartemisinina-piperaquina para reducir la transmisión de Plasmodium falciparum en Ouelessebougou, Malí: un ensayo clínico aleatorizado simple ciego de fase 2. Lancet Microbe 3, e336–e347 (2022).

Trager, W. & Jensen, JB Parásitos de la malaria humana en cultivo continuo. Ciencia 193, 673–675 (1976).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, JP y Avery, VM Producción a gran escala de gametocitos de Plasmodium falciparum para el descubrimiento de fármacos contra la malaria. Nat. Protocolo 11, 976–992 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Siciliano, G. et al. Una alta susceptibilidad al desequilibrio redox de las etapas transmisibles de Plasmodium falciparum revelada con un ensayo de gametocitos maduros basado en luciferasa. mol. Microbiol. 104, 306–318 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J.-H., Chung, TDY y Oldenburg, KR Un parámetro estadístico simple para usar en la evaluación y validación de ensayos de detección de alto rendimiento. J. Biomol. Pantalla. 4, 67–73 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lavazec, C. et al. en Malaria: Methods and Protocols (ed. Ménard, R.) 291–297 (Humana Press, 2013).

Lambros, C. & Vanderberg, JP Sincronización de estadios eritrocíticos de Plasmodium falciparum en cultivo. J. Parasitol. 65, 418–420 (1979).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Medicines for Malaria Venture (MMV) por proporcionar la caja de patógenos ya GSK por proporcionar la caja de inhibidores de cinasa. Agradecemos al prof. Pietro Alano por proporcionar la cepa 3D7 pULG8-GFP de P. falciparum y Françoise Benoit-Vical por proporcionar la cepa F32-TEM. Estamos muy agradecidos con Jeremy Burrows y Didier Leroy de MMV y con Laurent Fraisse de Drugs of Neglected Diseases Initiative (DNDi) por su revisión crítica de todo el proyecto. Agradecemos a Theravance Biopharma Inc. como patrocinador del ensayo clínico descrito aquí y a sus ex vicepresidentes senior Brett Haumann (patrocinador signatario del estudio) y Philip Worboys por recopilar y analizar los datos del ensayo y ponerlos a disposición para este documento, como así como al Director Ejecutivo Wayne Yates por su constante apoyo. También agradecemos a María Jesús Almela-Armendariz y Jorge Fernández Molina de GSK por su apoyo técnico. Agradecemos a la Fundación Bill & Melissa Gates por la subvención OPP1123683 y a la Fundación Tres Cantos OpenLab por la subvención TC180 obtenida por PB Agradecemos también el apoyo de NIH (R01HL154150) a MD y el apoyo de HRA Pharma y André Ulmann a JD

Estos autores contribuyeron igualmente: Mario Carucci, Julien Duez.

Universidad Paris Cité, Inserm, UMR-1134, Biología Integrada de los Glóbulos Rojos, 75015, París, Francia

Mario Carucci, Aurélie Fricot-Monsinjon, Abdoulaye Sissoko, Lucie Dumas, Babette Beher, Pascal Amireault, Camille Roussel, Papa Alioune Ndour y Pierre Buffet

SYNSIGHT, 91000, Évry-Courcouronnes, Francia

julián duez

Unidad de Investigación de Medicina Tropical Mahidol-Oxford, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, 10400, Bangkok, Tailandia

Joel Tarning

Centro de Medicina Tropical y Salud Global, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Joel Tarning

Laboratorio de Referencia de Micología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, 28222, Madrid, España

Irene García-Barbazan

I+D de Medicamentos para la Salud Global, GlaxoSmith Kline (GSK), 28760, Tres Cantos, España

Pablo Gamallo, Laura Maria Sanz & Francisco Javier Gamo

Laboratorio de mecanismos celulares y moleculares de los trastornos hematológicos e implicaciones terapéuticas, INSERM, 75014, París, Francia

Pascal Amireault y Michael Dussiot

Laboratorio de Excelencia GR-Ex, París, Francia

Michael Dussiot y Camille Roussel

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Instituto de Tecnología de Massachusetts, MA, 02139, Cambridge, EE. UU.

ming dao

Calibr, una división del Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, 92037, EE. UU.

Mitchell V. Casco y Caso W. McNamara

Laboratorio de Hematología General, Hospital Universitario Necker Children Sick, Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), 75015, París, Francia

Camila Roussel

Departamento de Enfermedades Infecciosas y Tropicales, AP-HP, Hospital Necker, 75015, París, Francia

pierre buffet

Centro Médico Institut Pasteur (CMIP), Institut Pasteur, 75015, París, Francia

pierre buffet

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

MC escribió el manuscrito, contribuyó a la configuración del ensayo de detección y realizó los experimentos de detección y posteriores a la detección. JD preparó el ensayo de detección. IG-B. brindó apoyo técnico para la campaña de tamizaje primario. BB, AF-M., AS y LD brindaron apoyo técnico para los experimentos de validación posteriores a la selección. PA y CR supervisó los experimentos de citometría de flujo de imágenes. MD realizó experimentos de citometría de flujo de imágenes. MD estableció la interpretación de los datos de detección en función del análisis de regresión de la detección primaria. PG contribuyó al análisis de detección primaria. CWM y MVH brindaron soporte técnico e información para todo lo relacionado con la biblioteca ReFrame. PAN revisó críticamente los resultados y el manuscrito. FJG y LSA supervisaron conjuntamente la campaña de detección primaria en GSK DDW. PB concibió todo el proyecto, supervisó y coordinó la actividad experimental y escribió y editó el manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito.

Correspondencia a Pierre Buffet.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Julian Rayner y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Carucci, M., Duez, J., Tarning, J. et al. Medicamentos seguros con alto potencial para bloquear la transmisión de la malaria revelados por una prueba de detección mimética del bazo. Nat Comun 14, 1951 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37359-2

Descargar cita

Recibido: 20 julio 2022

Aceptado: 15 de marzo de 2023

Publicado: 07 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37359-2

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.