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Apr 02, 2023

Identificación de la edad

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2836 (2023) Citar este artículo

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Uno de los eventos clave en la encefalitis viral es la capacidad del virus para ingresar al sistema nervioso central (SNC). Varios virus encefalíticos, incluido el virus La Crosse (LACV), inducen principalmente encefalitis en niños, pero no en adultos. Este fenómeno también se observa en modelos de ratones LACV, donde el virus accede al SNC de animales destetados a través de fugas vasculares de microvasos cerebrales, probablemente a través de células endoteliales capilares cerebrales (BCEC). Para examinar los factores reguladores de la fuga vascular específicos de la edad y la región, utilizamos la transcriptómica de todo el genoma y la detección selectiva de ARNip para identificar genes cuya supresión afectó la patogénesis viral en BCEC. El análisis adicional de dos de estos productos génicos, Connexin43 (Cx43/Gja1) y EphrinA2 (Efna2), mostró un efecto sustancial en la patogénesis de LACV. La inducción de Cx43 por ácido 4-fenilbutírico (4-PBA) inhibió la enfermedad neurológica en ratones destetados, mientras que la deficiencia de Efna2 aumentó la enfermedad en ratones adultos. Por lo tanto, mostramos que Efna2 y Cx43 expresados ​​​​por BCEC son mediadores clave de la neuroinvasión y la enfermedad neurológica inducida por LACV.

El virus de La Crosse (LACV), un virus de ARN de sentido negativo que pertenece a la familia bunyaviridae1, es una de las principales causas de encefalitis arboviral en niños2. En adultos, la infección por LACV generalmente causa un síndrome febril muy leve3. La mayor incidencia de enfermedades neurológicas en niños en comparación con los adultos sugiere diferencias relacionadas con la edad que pueden ser responsables de la capacidad del virus para acceder al sistema nervioso central (SNC) y/o causar daño dentro del SNC. Comprender estas diferencias podría proporcionar vías para la prevención o el tratamiento de la encefalitis por LACV.

La barrera hematoencefálica (BBB) ​​es una barrera selectivamente permeable que juega un papel importante en la inhibición del acceso de patógenos al SNC. La barrera hematoencefálica (BBB) ​​se compone principalmente de células endoteliales de los capilares cerebrales (BCEC) con astrocitos vecinos, membrana basal y pericitos, que interactúan con las neuronas circundantes y la microglía para formar la unidad neurovascular4. La permeabilidad selectiva a través de las BCEC está definida por varias proteínas transportadoras y transportadoras junto con la unión estrecha (TJ), la unión adherente (AJ) y la unión gap (GJ) (proteínas de unión celular (CJ))5,6. La integridad del BBB se fortalece durante el desarrollo7,8. Alcanza su punto máximo en la edad adulta y luego se debilita gradualmente con la edad debido a la reducción de la expresión de la proteína CJ y al deterioro funcional de los transportadores9,10.

La patología observada a partir de la encefalitis por LACV indica una ruptura sustancial de la BBB. El análisis inmunohistoquímico (IHC) de biopsias cerebrales de pacientes con LACV muestra un manguito mononuclear perivascular con agregados focales de células inmunitarias11, y estudios adicionales han demostrado lesión vascular inducida por encefalitis por LACV12. Por lo tanto, la encefalitis por LACV está estrechamente asociada con patología y anomalías neurovasculares.

En el modelo de ratón C57BL/6 se observa una encefalitis por LACV y una patología vascular similarmente dependientes de la edad. Los ratones destetados (~3 semanas de edad) son muy susceptibles a la infección por LACV del SNC y desarrollan una enfermedad clínica después de una infección periférica (intraperitoneal, IP) o directa del SNC (intracerebral, IC). Por el contrario, los ratones adultos de ≥6 semanas de edad son resistentes a la infección periférica (IP) pero son susceptibles a la infección directa del SNC (IC)13,14,15. Por lo tanto, existe una clara diferencia relacionada con la edad en la capacidad de LACV para acceder al SNC después de una infección periférica.

Los estudios sobre la susceptibilidad relacionada con la edad muestran un aumento de la fuga vascular y la descomposición de la BBB en ratones jóvenes después de la infección por LACV. Aunque las BCEC infectadas con LACV no se observan fácilmente in vivo, la descomposición de la BBB está mediada por fugas específicamente a través de los microvasos/BCEC en la región del bulbo olfatorio (OB)/núcleo olfatorio anterior (AON), pero no en la corteza (CT). ) región16. La fuga viral generalmente alcanza su punto máximo a los 3 días posteriores a la infección (dpi) y se observa infección viral de las neuronas en regiones asociadas con esta fuga vascular. En un estudio anterior, demostramos que una respuesta específica de la edad de los microvasos cerebrales/BCEC provoca efectos citopáticos diferenciales y susceptibilidad a LACV. Además, utilizando fragmentos de microvasos cerebrales aislados ex vivo y cultivos in vitro de BCEC primarios aislados de ratones recién destetados y adultos, demostramos que los BCEC recién destetados son más propensos a la infección por LACV, la formación de agregados similares a sincitios y la muerte de células transeúntes17. Las respuestas de BCEC pueden estar controladas por varios factores, incluida la respuesta inmunitaria del huésped, la supervivencia celular, la expresión de proteínas CJ funcionales, el mantenimiento de los vasos sanguíneos o por interacciones multigénicas. La identificación de los factores que difieren entre los microvasos/BCEC cerebrales del destete y del adulto durante la infección por LACV puede proporcionar información sobre los factores que son críticos para prevenir la neuroinvasión por LACV.

Presumimos que los factores de restricción putativos pueden estar presentes o potenciados en los ratones adultos resistentes a LACV, mientras que los factores de susceptibilidad putativos pueden predominar en los ratones destetados susceptibles a LACV. Para identificar dichos factores, primero utilizamos el análisis de transcriptoma basado en la secuenciación de ARN (RNA-seq) en fragmentos de microvasos cerebrales aislados ex vivo obtenidos de ratones destetados y adultos y evaluamos las respuestas a poliinosínico: ácido policitidílico (poli I: C) para imitar la inducción de virus. inmunoestimulación. Además, comparamos los perfiles de RNA-seq en fragmentos de microvasos cerebrales aislados de la región OB y ​​CT de ratones destetados infectados con LACV o inoculados de forma simulada. Los genes candidatos que muestran perfiles de expresión diferenciales de estos análisis se sometieron a una pantalla de ARN de interferencia pequeña (siRNA) dirigida para identificar los reguladores putativos de la susceptibilidad a LACV dependiente de la edad. Se evaluaron los genes hit para determinar su sitio de participación potencial en la vía infecciosa de LACV, y se identificaron dos genes, la proteína de unión alfa 1 (Gja1) y la ephrinA2 (Efna2) como objetivos terapéuticos potenciales para controlar la fuga vascular inducida por LACV y el establecimiento de neuroinfección.

Primero buscamos identificar reguladores de genes candidatos que contribuyan a la susceptibilidad dependiente de la edad a LACV. Los ratones destetados (W) y adultos (A) se trataron con poli I:C (PI) durante 3 h (como sustituto de un estímulo de ARN viral) o control de vehículo (V). Los fragmentos de microvasos cerebrales completos aislados de estos ratones se sometieron a análisis de ARN-seq para identificar genes intrínsecamente dependientes de la edad o inducidos por estimulación Poly I: C (Fig. 1a). La expresión génica se comparó en cuanto a las diferencias relacionadas con la edad del nivel basal comparando los grupos de vehículo de destete (WV) frente a los grupos de vehículo adulto (AV). Las comparaciones de activación se realizaron comparando Weanling poli I:C estimulado (WPI) frente a WV, Adulto poli I:C estimulado (API) frente a AV, así como WPI frente a API. Los gráficos de volcanes de expresión génica diferencial y los análisis de enriquecimiento de vías (Ingenuity Pathway Analysis, IPA), de las comparaciones anteriores, resaltan los procesos celulares que distinguen los diferentes tratamientos y grupos de edad (Fig. 1a-d complementaria). Se seleccionaron genes específicos para una evaluación adicional en función de la expresión diferencial entre grupos con una diferencia log2 de ≥ 1, p < 0,05 y base media ≥ 100 (Tabla complementaria 1, Grupo 1). Para evaluar la composición celular probable en los fragmentos de microvasos aislados, evaluamos la expresión de genes específicos del tipo de célula a partir de los datos de secuenciación de ARN (Tabla complementaria 2). Esto mostró que los genes específicos de BCEC estaban muy enriquecidos, había una expresión moderada/baja de marcadores de pericito, pero muy poca expresión de genes característicos de astrocitos, neuronas y células de músculo liso. Esto confirmó que el método utilizado para la preparación de fragmentos de microvasos resultó en un enriquecimiento BCEC altamente específico, como se describió anteriormente18,19,20.

un enfoque secuencial para seleccionar genes diana a partir de análisis de RNA-seq en ratones destetados (W) o adultos (A) tratados con vehículo (V) o Poly I:C (PI) (WV, WPI, AV y API). b Identificación de genes diana a partir de análisis de secuencias de ARN de fragmentos de microvasos del bulbo olfatorio (OB) y regiones de la corteza (CT) de ratones recién destetados infectados con LACV (LOB y LCT) y ratones inoculados de forma simulada (MOB y ​​MCT) (N = 3 para todos los ratones -seq muestras). Se aplicó la función DESeq predeterminada con betaPrior = FALSE, en la que se realizó un modelo binomial generalizado negativo con la prueba de Wald para la significación. Los valores de p bilaterales se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini Hochberg. c–e Expresión diferencial de genes representativos, validada por análisis de PCR en tiempo real en fragmentos de microvasos aislados ex vivo de ratones infectados con destete simulado (WM), destete LACV (WL), adulto simulado (AM) y adulto LACV (AL). Categorías de genes: (c) intrínseco específico del adulto (para Efna2 y H2q6 WM frente a AM P = 0,0032 y P = 0,0001 y WL frente a AL P = 0,0002 y P = 0,0356), d intrínseco específico del destete (para Bst1 y Mmp25 WM frente a AM P < 0,0001 y P = 0,1010 y WL vs AL P < 0,0001 y P = 0,4684) o (e) genes potenciados en adultos inducidos por infección por LACV (para Clec4e y Cldn1 WM vs AM P = 0,0453 y P = 0,0894 y WL vs AL 0,6490 y P = 0,5686). f Expresión diferencial de genes representativos de fragmentos de microvasos OB y ​​CT obtenidos de adultos infectados con LACV (AOB y ACT) y destetados (WOB y WCT). P = 0,0043 y P = 0,0068 para Aqp1 y Ttr para comparación WOB vs WCT y P = 0,0417 y P < < 0,0001 para Aqp1 y Ttr para comparación AOB vs ACT. Los datos en (c-f) se transformaron a escala log2 para una distribución más normal y los puntos de datos se analizaron estadísticamente o se trazaron después de la transformación. Los valores de significación se midieron mediante ANOVA unidireccional seguido de la comparación múltiple de Tukey (c-e) o pruebas t no pareadas múltiples de dos colas (f) (N = 5-6 para todos los experimentos con ratones, del Panel c-f y se muestran los puntos de datos). (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001).

Como se observan diferencias regionales en la integridad de BBB después de la infección por LACV y la infección por el virus se observa por primera vez en la región OB en ratones destetados16, también completamos un análisis de ARN-seq en fragmentos de microvasos aislados de diferentes regiones de infectados con LACV (L) y simulados. cerebros de ratones destetados inoculados (M) a 3 ppp. Los genes de esta comparación se seleccionaron en función de dos criterios de expresión génica diferencial: una diferencia en la expresión entre fragmentos de microvasos del OB de ratones infectados con LACV (LOB) frente al OB de ratones con infección simulada (MOB), o una diferencia en el gen expresión entre LOB versus fragmentos de microvasos de CT de ratones infectados con LACV (LCT) (Fig. 1b). Estos criterios se utilizaron para seleccionar genes adicionales para su posterior análisis (Tabla complementaria 1, Grupo 2). La expresión génica diferencial y los análisis de IPA de estas comparaciones resaltan el enriquecimiento esperado de interferón y neuroinflamación después de la infección por LACV del OB, y las diferencias en la señalización de Gap Junction y Ephrin en la comparación OB/CT (Figura complementaria 1e, f). Finalmente, además de los genes seleccionados del Grupo 1 y 2, también incluimos genes que se sabe que afectan la función de BBB y la respuesta inmune del huésped a LACV, pero no necesariamente diferenciados en el análisis de secuencia de ARN anterior (Tabla complementaria 1, Grupos 3 y 4, respectivamente).

Para confirmar aún más las diferencias de expresión de los genes seleccionados, analizamos la expresión por qPCR después de la infección por LACV. Los ARN se extrajeron de fragmentos de microvasos obtenidos de ratones adultos (AL) o destetados (WL) infectados con LACV a 3 ppp, así como ratones destetados (WM) y adultos (AM) inoculados de forma simulada, mientras que se extrajeron fragmentos de microvasos adicionales de OB y Regiones CT de ratones destetados y adultos infectados con LACV (3 ppp). Los análisis de PCR en tiempo real en fragmentos de microvasos aislados ex vivo mostraron genes que se clasifican en cuatro categorías principales, mejorados para adultos, mejorados para el destete, inducidos por LACV y específicos de la región (OB-CT) (Fig. 1c-f). Por ejemplo, ephrinA2 (Efna2; una molécula angiogénica) y H2q6 (perteneciente a la familia MHC de clase I) se expresaron en niveles más altos en fragmentos de microvasos adultos, independientemente de la infección por el virus (Fig. 1c). El antígeno 1 de células del estroma de la médula ósea (Bst1; un regulador inmunitario) y la metalopeptidasa de matriz 25 (Mmp25) tenían niveles basales más altos en ratones destetados (Fig. 1d). La familia de dominios de lectina tipo C 4, miembro e (Clec4e; una molécula que reconoce LACV y juega un papel limitado en las respuestas antivirales tempranas contra LACV21) y claudina 1 (Cldn1; una proteína TJ presente en las células endoteliales/epiteliales) aumentaron con LACV infección en ratones adultos, pero no en ratones destetados (Fig. 1e). Solo unos pocos genes se expresaron diferencialmente entre los fragmentos de microvasos OB y ​​CT. Entre estos, dos genes de mantenimiento de la homeostasis, acuaporina 1 (Aqp1; un transportador pasivo) y transtiretina (Ttr; una proteína transportadora) aumentaron en fragmentos de microvasos CT de ratones destetados (WCT) y adultos (ACT) en comparación con fragmentos de microvasos OB obtenidos de ratones destetados (WOB) y adultos (AOB). La comparación por pares entre los fragmentos de microvasos OB y ​​CT se muestra para cada grupo de edad (Fig. 1f). Por lo tanto, identificamos genes mediante análisis de secuencias de ARN (Fig. 1a, b) y qPCR (Fig. 1c-f) que se expresaron de manera diferente en fragmentos de microvasos por edad, infección o región para un estudio adicional.

Para examinar directamente si los genes seleccionados pueden influir en la patogénesis viral, utilizamos un modelo in vitro de infección por LACV de células endoteliales. Anteriormente descubrimos que, aunque las células endoteliales infectadas no se detectan fácilmente in vivo, se infectan de manera dependiente de la edad in vitro y esta infección se asocia con daño directo y transeúnte a las células endoteliales17. Para establecer un ensayo de cribado basado en células de perturbación génica, elegimos una línea celular de endotelioma de ratón, bEnd.3, ya que estas células podían infectarse con LACV y eran fácilmente aptas para la transfección de siRNA. Para optimizar la entrega de siRNA, empleamos siRNAs de control letales y no dirigidos (NT) para probar diferentes reactivos de transfección e identificar condiciones con la máxima muerte celular con siRNA letal mientras mantenemos la máxima viabilidad con el control si-NT. Esto identificó un protocolo de entrega óptimo utilizando ARNsi 50 nM con el reactivo de transfección Transit TKO (Figura complementaria 2a). Luego, establecimos tres condiciones de control para la pantalla: a) una condición de referencia para la infección por LACV con ARNip de NT, b) un control para factores de restricción conocidos usando una combinación de ARNip para Ifnar1 e Ifnar2 (si-Ifnar o si-Upreg. Control; infección por LACV regulada al alza) yc) un control para factores de susceptibilidad conocidos usando una combinación de siRNA para la cadena pesada de clatrina y Rab5a (si-CltcRab o si-Downreg. Control; infección por LACV regulada a la baja) (Fig. 2b, c complementarias).

Luego seleccionamos los 35 genes seleccionados que se muestran en la Tabla complementaria. 1 junto con las tres condiciones de control en tres fases diferentes de infección por LACV en monocapas de BCEC a temperatura ambiente. La primera fue la fase temprana (6 hpi; Fig. 2a), lo que sugeriría un efecto sobre la entrada del virus. La segunda fue la fase infecciosa media (24 hpi; Fig. 2b), lo que sugiere un efecto sobre la replicación y propagación del virus a través del cultivo de células endoteliales. Estas fases cinéticas se han observado de manera similar para la infección por LACV en una línea celular diferente22. El ensayo basado en células para estas dos primeras fases utilizó un anticuerpo anti-LACV para medir la intensidad de la fluorescencia viral por célula. Esto se determinó midiendo la intensidad de la suma de LACV (que se ve afectada tanto por el número de células infectadas como por la intensidad de la infección) y luego cuantificando la relación con el área de Hoechst (que normaliza el valor de intensidad con respecto al número total de células). El último ensayo de fase tardía (72 hpi; Fig. 2c) midió la pérdida celular a través de la muerte celular inducida por LACV. Usando estos criterios, se esperaría que la eliminación de los factores de restricción putativos proporcione una mayor intensidad de LACV y una viabilidad celular reducida, mientras que la eliminación de los factores de susceptibilidad putativos conduciría a una intensidad de LACV reducida y una viabilidad celular más alta. Identificamos dos grupos de genes que mostraron fenotipos putativos de resistencia o susceptibilidad (color resaltado en la Fig. 2a-c), con imágenes representativas de la regulación positiva o negativa del virus que se muestran en la Fig. 3 complementaria.

Las células bEnd.3 se transfectaron con ARNsi 50 nM contra los genes diana indicados (durante 72 h), junto con control de regulación positiva viral (es decir, si-Ifnar1 e Ifnar2, abreviado como si-Upreg. Control), control de regulación negativa (es decir, si -Cltc y Rab5a, abreviados como si-Downreg.Control), controles no dirigidos (si-NT, línea punteada) y muerte celular (si-Lethal) donde se indique. a, b Análisis del grado de infección (10 MOI de LACV) normalizados a si-NT (índice de suma de intensidad de LACV a área de Hoechst) a las 6 (a) y 24 hpi (b). c Análisis de supervivencia celular (recuento nuclear) a las 72 hpi. La primera barra representa el promedio de 2 siRNA específicos de genes independientes, mientras que las siguientes dos barras representan siRNA # 1 y # 2 para cada gen (media ± SD, N = 3 cada siRNA individual). Los genes de acierto putativo se combinan en color en los diferentes gráficos.

Los factores de restricción putativos identificados en el examen primario incluyeron Efna2, Clec4e, Gja1 (expresado como proteína Connexin43, abreviado como Cx43), proteína transmembrana 3 inducida por interferón (Ifitm3, un factor de restricción viral de ARN), antígeno linfocitario 6 complejo locus C2 (Ly6c2) y H2q6. Para H2q6, hubo una variación entre las 6 y las 24 horas en el fenotipo, y solo se observó un aumento de la intensidad viral en el punto de tiempo temprano (Fig. 2a, b). Se observaron grupos de agregación similar a sincitios y células multinucleadas en cultivos de eliminación de H2q6, lo que podría explicar la limitación del fenotipo de mayor intensidad viral al punto de tiempo temprano (flechas blancas, Fig. 3a, b complementarias). La caída de Gja1 causó la disociación de la monocapa celular (flecha blanca, Fig. 3b complementaria), de acuerdo con su papel establecido en la integridad de la unión gap. Los factores de susceptibilidad putativos incluyeron factor de crecimiento endotelial vascular A (Vegfa), proteína de remodelación del citoesqueleto de actina gelsolina (Gsn), claudina 2 (Cldn2), claudina 5 (Cldn5) y proteína de unión estrecha 2 (Tjp2/ZO2) (Fig. 2a-c ). Por lo tanto, se identificaron múltiples genes que mejoraron o redujeron la infección in vitro por LACV de células endoteliales bEnd.3.

Sobre la base de la pantalla de siRNA dirigida, elegimos siete factores de restricción putativos (genes del Grupo 1: Bst1, Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3 y Ly6c2) para una mayor validación en BCEC adultos primarios y recién destetados. Curiosamente, la eliminación de todos estos genes aumentó la susceptibilidad de los BCEC primarios adultos a la infección por LACV (Fig. 3a), mientras que solo la eliminación de Ifitm3 mostró un nivel de infección significativamente mayor en los BCEC primarios de destete (Fig. 3b), lo que respalda la premisa de que estos genes pueden contribuir al aumento de la resistencia a LACV en BCEC adultos.

a, b Los BCEC primarios adultos (a) y destetados (b) se transfectaron con ARNip 50 nM durante 72 h contra los genes afectados del Grupo 1 indicados (principalmente factores de restricción) y la infección por LACV (relación entre la intensidad de la suma de LACV y el área de Hoechst) fue evaluado (N = 6 y se muestran puntos de datos individuales) Aquí, P = 0,0162, 0,0085, 0,0153, 0,0830, 0,0394, 0,0636, 0,0231 y 0,0271 en (a) y P = 0,6571, 0,9010, 0,0960, 0,1548, 0 .9290, 0.0354, 0.0649 y <0,0001 en (b) para si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 y si-Upreg. control vs si-NT, respectivamente. c Ensayo de unión/entrada de LACV en células bEnd.3 transfectadas con 50 nM del siRNA específico del gen indicado y de control durante 72 h e infectadas con 10 MOI de LACV durante 24 h. d Imágenes representativas de la unión/entrada de LACV en células bEnd.3 perturbadas con siRNA de Ifitm3 y Lyc2 (verde: LACV y azul: Hoechst) (N = 3 para c, d). Aquí, P = 0,0682, 0,0752, 0,9479, 0,3786, 0,3018, 0,0009, 0,0020 y 0,9574 en (c, izquierda) y P = 0,0980, 0,9622, 0,6042, 0,4154, 0,9939, 0,013 2, 0.0011 y 0.0294 en (c, derecha) para si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3, si-Ly6c2 y si-Upreg. control vs si-NT, respectivamente. e Ensayos de placa (cada punto = 1 muestra) realizados a las 24 hpi en células bEnd.3 infectadas con LACV transfectadas durante 72 h con 50 nM del siRNA específico del gen indicado. Aquí, P = 0,5075, 0,0030, 0,7566, 0,1347, 0,0120, 0,7941 y 0,0156 para si-Bst1, si-Efna2, si-H2q6, si-Clec4e, si-Gja1, si-Ifitm3 y si-Ly6c2 frente a si-NT, respectivamente. f Las células bEnd.3 se transfectaron con 50 nM del siRNA indicado durante 72 h, se infectaron con 10 MOI LACV y se usó microscopía confocal para obtener imágenes de la infección por LACV (verde), actina (rojo: faloidina) y núcleos (azul: Hoechst). a, b Se realizaron múltiples pruebas t pareadas de dos colas y c–e múltiples pruebas t no pareadas de dos colas entre si-NT y los genes objetivo (*P < 0.05, **P < 0.01, *** Se muestran P < 0,001 y ****P < 0,0001) y la media ± DE (3 a 6 muestras por condición). d, f Las imágenes son representativas de 25 a 75 campos independientes. Barra de escala = 100 um (blanca, para imágenes normales), barra de escala = 10 um (amarilla, para imágenes ampliadas).

También probamos factores de susceptibilidad putativos para la validación en cultivo primario (genes del Grupo 2: Cldn2, Tjp2, Cldn5, Vegfa, Mmp8, Mmp25 y Gsn). La eliminación de Mmp25, un gen mejorado de destete, condujo a una intensidad reducida de LACV en BCEC primarios tanto adultos como de destete (Fig. S4), lo que sugiere que este gen huésped puede facilitar la infección por LACV. Sin embargo, solo se observaron efectos marginales para los otros factores de susceptibilidad putativos en BCEC primarios. Dado que observamos una mayor frecuencia de validación de aciertos para los genes del Grupo 1 en las células primarias, nos centramos en los genes de este grupo para un análisis más detallado.

En un esfuerzo por diseccionar los mecanismos de inhibición del virus, utilizamos las células bEnd.3 para examinar las etapas en las que la perturbación de los factores de restricción putativos puede limitar la replicación del virus. Los ensayos de unión/entrada (que inducen la unión viral a baja temperatura, consulte la sección de métodos) mostraron que dos genes, Ly6c2 e Ifitm3, restringían la entrada viral (Fig. 3c). En comparación con si-Ly6c2, la caída de si-Ifitm3 provocó una regulación positiva más pequeña del recuento de células infectadas, así como la intensidad/célula de LACV (Fig. 3c, d). Luego realizamos ensayos de placas y descubrimos que la perturbación de Ly6c2, Gja1 y Efna2 aumentó la producción de virus a las 24 hpi (Fig. 3e).

En nuestra pantalla principal, habíamos notado que la eliminación del gen H2q6 también inducía la formación de agregaciones similares a los sincitios en las células bEnd.3 (Fig. 3a, b complementarias). Para investigar esto más a fondo, las células control y bEnd.3 perturbadas con H2q6 se tiñeron conjuntamente tanto para LACV como para F-actina. Se ha informado previamente que las proteínas del citoesqueleto de actina se alteran en OB BCEC después de la infección por LACV16. Observamos que LACV se colocalizó con la red de actina en las células de control, específicamente en la periferia celular y las extensiones lamellipodiales (flecha delgada, panel superior, Fig. 3f). Sin embargo, en la condición de eliminación de H2q6, específicamente en las células que tienen dos o más núcleos (formando una agregación similar a sincitios), observamos la interrupción de la tinción regular de actina filamentosa y la tinción granular de actina y LACV ubicada alrededor de los núcleos celulares (flecha gruesa, panel inferior , Fig. 3f) lo que sugiere una posible alteración del tráfico de virus. Por lo tanto, la validación in vitro de los factores de restricción viral putativos (Efna2, H2q6, Clec4e, Gja1, Ifitm3) identificados a partir de nuestra pantalla de siRNA enfocada sugiere posibles roles para genes hospedantes seleccionados en la restricción o alteración de la entrada viral, el tráfico o la liberación de partículas virales en LACV -Células endoteliales infectadas.

Uno de los genes primarios que afectó significativamente la infección por LACV de las células endoteliales fue Efna2, que es intrínsecamente abundante en BCEC adultos. La proteína EFNA2 codificada es un factor angiogénico23 que lleva a cabo respuestas de señalización a través de receptores de clase EphrinA (EphA)24. Para examinar más a fondo EFNA2, probamos si la proteína EFNA2 de ratón recombinante (rec-EFNA2) podría restringir la infección por LACV en BCEC primarios de destete y adultos. Se cultivaron BCEC primarias adultas y de destete, se infectaron con LACV (10 multiplicidades de infección; abreviado como MOI), luego se mantuvieron en medio acondicionado o de control con EFNA2 hasta 72 h después de la infección. Se utilizaron dos concentraciones diferentes de EFNA2, baja (2 ug/ml) o alta (20 ug/ml). Tras el tratamiento con rec-EFNA2, los BCEC de destete mostraron niveles reducidos de infección por LACV a las 24 hpi, lo que fue significativo para la alta concentración de EFNA2 (Fig. 4a). Los BCEC adultos, ya en su mayoría resistentes a la infección por LACV, mostraron una reducción parcial pero no significativa de la infección. Por lo tanto, EFNA2 agregado exógenamente puede restringir la replicación de LACV in vitro en BCEC destetados (Fig. 4a).

a Efecto de EFNA2 recombinante (2 ug/ml a 20 ug/ml) en los niveles de infección por LACV en BCEC de recién destetados y adultos a las 24 y 72 hpi (N = 4–12 muestras individuales, datos recopilados en base a 25 imágenes para cada muestra, P = 0,1654 y 0,0475 para 2 ug/ml y 20 ug/ml, en comparación con el control, en BCEC de destete y P = 0,1068 y 0,0846 para 2 ug/ml y 20 ug/ml, en comparación con el control, en BCEC de adultos). b Se infectaron ratones adultos Efna2-/- (m), Efna2+/- (m) y WT con 105 UFP LACV (IP) y se muestra el porcentaje de ratones neurológicos. Ver suplemento Tabla 3 para genotipos Efna3/5 mixtos de ratones Efna2-/- (m) y Efna2+/- (m) (N = 22 ratones WT o Efna2+/- (m) y N = 18 ratones Efna2-/- (m), P = 0,0105). c Niveles de ARN de LACV en el cerebro de ratones infectados a 8–22 ppp (NC: ratones no clínicos y C: ratones clínicos donde N = 18 WT o Efna2+/− (m) ratones NC, N = 2 WT o Efna2+/− (m ) ratones C, N = 10 Efna2-/- (m) ratones NC y N = 8 Efna2-/- (m) ratones C). Aquí, P = 0,0008 para WT/Efna2+/− (m) C y Efna2−/− (m) C, en comparación con el control NC WT/Efna2+/− (m). d Fuga vascular evaluada mediante la medición del ARN viral en cerebros de ratones Efna2-/- (m) y WT infectados con LACV a 3 ppp (N = 8 cerebros de ratones con respecto a cada condición analizada). e Imágenes para detectar fugas vasculares en cortes de cerebro de ratones WT y Efna2-/- (m) infectados con LACV a 3 ppp (flecha, perlas FluoSphere: rojo, Hoechst: azul). Las flechas gruesas representan la localización de las perlas de FluoSphere en la periferia del SNC en ratones WT, mientras que las flechas finas representan la fuga de perlas de FluoSphere en el parénquima cerebral en ratones Efna2-/- (m) (1 de cada 4 ratones mostró fuga, que se representa aquí). (a, ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Dunnett, b, prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox y c, d múltiples pruebas t no pareadas de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01 y *** P < 0,001). Barra de escala = 100 um.

Para examinar si Efna2 tiene un papel en la restricción de la infección por LACV del SNC in vivo, analizamos el desarrollo de enfermedades neurológicas en ratones adultos normalmente resistentes deficientes en miembros de la familia Efna. Inicialmente, probamos ratones de más de 6 semanas de edad que tenían genotipos de deficiencia mixtos para Efna2, Efna3 y Efna5 (Efna2-/- mixto; abreviado como Efna2-/- (m)), como se detalla en la Tabla complementaria 3. Todos los ratones se distribuyeron en dos grupos : homocigoto para deficiencia de Efna2 con genotipos mixtos +/+, +/− o −/− para Efna3 y Efna5 (Efna2−/− (m) o heterocigoto para deficiencia de Efna2 con genotipos mixtos +/+, +/− o −/− para Efna3 y Efna5 (Efna2+/− (m)), así como ratones de tipo salvaje con genotipo Efna2+/+3+/+5+/+ (tipo salvaje, abreviado como WT).Después de la inoculación de 105 PFU/ratón, aproximadamente el 50 % de Los ratones Efna2-/- (m) desarrollaron enfermedad neurológica, independientemente de su genotipo Efna3 o Efna5 (Tabla complementaria 3).En contraste, la mayoría de los ratones WT o Efna2+/- (m) (~ 91%) no mostraron ningún signo de enfermedad neurológica (Fig. 4b). También observamos altos niveles de virus en los ratones Efna2-/- (m) con enfermedad neurológica clínica (C) versus ratones no clínicos (NC) (Fig. 4c). Por lo tanto, Efna2 parece tener un papel inhibitorio en la patogenia de LACV in vivo (Fig. 4b, c).

Para determinar si la deficiencia de Efna2 afecta la permeabilidad de BBB y la neuroinvasión de LACV, examinamos ratones a 3 ppp, cuatro días antes del inicio de los signos clínicos. Se detectó ARN de LACV en aproximadamente la mitad de los ratones Efna2 -/- (m), pero solo en un ratón del grupo WT y Efna2+/- (m) (Fig. 4d). A estos ratones Efna2-/- (m) infectados con LACV también se les inyectaron perlas rojas FluoSphere de ~100 nm (partículas del tamaño de un virus; tinción roja) a 3 ppp para controlar la fuga vascular. Las fluoroesferas se detectaron principalmente dentro de los vasos sanguíneos del SNC en ratones WT (flechas blancas gruesas). Sin embargo, en uno de los cuatro ratones Efna2-/-, se detectaron fluoroesferas dentro del parénquima cerebral (flechas blancas finas, Fig. 4e), lo que sugiere una fuga vascular temprana. Por lo tanto, el aumento de la enfermedad del 25 al 50 % en ratones Efna2-/- (m) se correlacionó con una mayor incidencia de detección temprana de ARN viral en el SNC y detección de fuga vascular en un subconjunto de estos ratones. Estos datos indican que Efna2 puede ser un factor de restricción importante en ratones adultos para prevenir la neuroinvasión de LACV.

Para aclarar si Efna2 en sí era el principal mediador de la restricción viral, comparamos la susceptibilidad a LACV en ratones adultos (> 6 semanas de edad) WT y Efna2-/-3+/+5+/+ (Efna2 single knockout (KO); abreviado como Efna2-/-(s)). Como era de esperar, los ratones WT adultos no fueron susceptibles a una dosis de LACV de 105 UFP/ratón (~96 % no neurológico). Por el contrario, aproximadamente el 38% de los ratones adultos Efna2-/- (s) desarrollaron una enfermedad neurológica en respuesta a la infección por LACV (Fig. 5a). Además, los fragmentos de microvasos aislados de ratones Efna2-/-(s) tenían niveles más altos de infección por LACV en comparación con WT a las 24 y 48 hpi (Fig. 5b, d) y una supervivencia reducida a las 72 y 96 hpi (Fig. 5c). También examinamos la fuga vascular in vivo usando fluoroesferas en ratones WT y Efna2-/- (s) usando un punto de tiempo ligeramente posterior de 5 ppp. Los ratones adultos WT no mostraron fugas vasculares, mientras que los ratones Efna2-/- (s) tuvieron una detección consistente de 1 a 3 focos de perlas fluorescentes en el parénquima cerebral (Fig. 5e, 5 de 7 ratones). Por lo tanto, los ratones Efna2-/- (s) fueron más susceptibles a la enfermedad neurológica inducida por LACV, lo que se correlacionó con un aumento de la fuga vascular en el SNC antes del inicio de la enfermedad. Esto también se correlacionó con una mayor infección por virus y una menor supervivencia celular en Efna2-/- (s) BCEC en comparación con WT BCEC (Fig. 5b, c). En conjunto, estos datos indican un papel importante para Efna2 en la integridad de BBB durante la infección por LACV.

a Comparación de enfermedad neurológica inducida por LACV (105 PFU/dosis de ratón (IP)) en ratones adultos WT y Efna2-/-. (*P < 0,05, ****P < 0,0001, prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox, N = 28 ratones WT y N = 43 ratones Efna2-/-, P = 0,0013). b Infección comparativa de BCEC después de la infección por LACV (10 MOI) a las 24 y 48 hpi en BCEC primarios WT y Efna2-/- (N = 33 y N = 18 para BCEC WT y Efna2-/-, se muestra la media ± SD, P < 0,0001 y P = 0,0041 para 24 y 48 hpi, respectivamente). c Viabilidad celular comparativa (recuento nuclear validado) de BCEC después de la infección por LACV (10 MOI) a 72 y 96 hpi en BCEC primarios WT y Efna2-/- (N = 24 y N = 12-18 para BCEC WT y Efna2-/- , se muestra la media ± DE, P < 0,0001 y P = 0,0304 para 72 y 96 hpi, respectivamente). Se muestran todos los puntos de datos individuales y se analiza la significación estadística mediante múltiples pruebas t no pareadas de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01 y ****P < 0,0001). d Imágenes representativas a 24 y 48 hpi que comparan WT y Efna2-/- BCEC (Hoechst: azul y LACV: verde). Barra de escala = 100 um (las imágenes son representativas de 25 imágenes/muestra individuales). e Se muestra una sección de cerebro WT representativa (sin ninguna fuga vascular) junto con 5 secciones de cerebro Efna2-/- que muestran fuga vascular (Hoechst: perlas azules y FluoSphere: rojo y barra de escala = 100 um) (N = 5 cerebros WT y N = 7 cerebros Efna2-/-, de los cuales 5 cerebros mostraron focos probables de fuga vascular). El número de focos/cerebros se comparó utilizando una prueba t no pareada (P = 0,0195).

Dado que la eliminación de Gja1 (que expresa la proteína Cx43) afectó la infección por LACV in vitro, planteamos la hipótesis de que la activación o regulación positiva de Cx43 podría reducir la infección y la patogénesis del virus. El ácido 4-fenilbutírico (4-PBA) es un activador conocido y potenciador de la formación de canales para varias conexinas, incluida la Cx43. Infectamos células bEnd.3 con LACV +/- 4-PBA e inmunoteñimos para LACV y Cx43 en diferentes momentos. El tratamiento con 4-PBA redujo significativamente la infección por LACV y aumentó la supervivencia de la célula huésped a las 96 hpi (Fig. 6a). Usando microscopía confocal, observamos que la reducción de la infección por LACV (LACV: verde) a las 96 hpi se correlacionó con la mejora de la formación de puntos Cx43 (Cx43: rojo). El aumento en la formación de puntos Cx43 (flechas blancas; denotado por tinción granular o laminar de Cx43) o la localización hacia la superficie celular fue dependiente de la dosis de 4-PBA (Fig. 6b)25. Como se observó en estudios previos25, la regulación positiva del nivel de proteína Cx43 fue confirmado por western blot (Fig. 6c). Por lo tanto, la regulación positiva inducida por 4-PBA en los niveles de proteína Cx43 o la formación de puntos se correlacionó con la inhibición de la infección por LACV in vitro.

a, b Células bEnd.3 infectadas con LACV (10 MOI), se trataron con 4-PBA (0–10 mM) y a diferentes hpi, se tomaron imágenes para medir (a) la intensidad viral o el agotamiento celular inducido por el virus (N = 4 muestras, datos recopilados en base a 25 imágenes obtenidas de cada muestra y se muestra la media con SD) o (b) localización de Cx43 (rojo), LACV (verde) y Hoechst (azul) (representativo de ~12–25 imágenes obtenidas en cada condición , P = 0,1142, < 0,0001 y 0,0097 de PBA 2,5, 5 y 10 mM, en comparación con PBA 0 mM). Las flechas blancas representan la tinción punteada de Cx43. c Western blot y análisis densitométricos de los niveles de proteína Cx43 en células bEnd.3 tratadas con 4-PBA. Gapdh es un factor de normalización y control de carga para la cuantificación (N = 3 para cada condición y se muestra la media con SD, P = 0,7647, 0,0043 y 0,4589 para PBA 2,5, 5 y 10 mM, que se comparan con PBA 0 mM). d Los ratones recién destetados, infectados con 2000 PFU de LACV, se trataron con vehículo (LV) o 500 mg/kg-día de 4-PBA (LP) hasta 5 dpi y se evaluó el punto final neurológico (N = 9 ratones para cada condición, P = 0,0074). e Efecto del tratamiento con 4-PBA en la correlación entre la expresión de LACV y Gja1 en cerebros de ratón a 3 ppp (N = 9 LV y N = 11 muestras de ARN de cerebro LP obtenidas de ratones, P = 0,0311 y 0,0147 para la comparación de LACV y Gja1). f Efecto de 4-PBA en la entrada y localización de LACV evaluado mediante imágenes confocales de cortes de cerebro de ratón a 4 ppp (rojo: ZO1, verde: LACV, azul: Hoechst/núcleos). (a) ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Dunnett y todos los grupos se compararon con el vehículo durante el mismo tiempo pi, (b) ANOVA de una vía seguido de la prueba de Dunnett, los puntos individuales representan campos de imágenes separados, (c) múltiples, de dos colas pruebas t no pareadas, d prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox y e, prueba t no pareada de dos colas donde *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 y N = 3–4 para cada experimento. Barra de escala = 100 um (blanca, para imágenes normales), barra de escala = 10 um (amarilla, para imágenes ampliadas).

Para examinar si el 4-PBA podría inhibir la enfermedad neurológica inducida por LACV, los ratones destetados infectados con LACV (~21–23 días de edad) se trataron diariamente con 500 mg/kg de 4-PBA de 0 a 5 ppp (inyección IP, LP). Los ratones infectados con LACV y tratados con vehículo (LV) se analizaron en paralelo. Los ratones LV exhibieron enfermedad neurológica entre 6 y 8 dpi. Por el contrario, los ratones LP habían retrasado el desarrollo de la enfermedad neurológica (Fig. 6d). En el punto final neurológico, los niveles de virus y los niveles de expresión de ARNm de Gja1 fueron similares en los grupos tratados con vehículo y 4-PBA (Figura 5 complementaria). Sin embargo, un análisis anterior a 3 ppp, cuando el virus invade por primera vez el SNC, demostró que los animales LP tenían niveles reducidos de virus, lo que se correlacionó con un aumento en la expresión del ARNm de Gja1 (Fig. 6e). A los 4 ppp, se aislaron cerebros de ratones LV y LP y se tiñeron conjuntamente para el marcador endotelial ZO1 y LACV. Los ratones LV mostraron una presencia persistente y prominente de tinción LACV en la región OB y ​​OT del cerebro (Fig. 6f; paneles superiores). Por el contrario, los ratones tratados con 4-PBA no tenían LACV detectable (3 de 4 ratones) o una tinción viral mucho más limitada (1 de 4 ratones, (Fig. 6f; paneles inferiores)) en comparación con los controles del vehículo. Las imágenes de mayor aumento mostraron una infección por LACV prominente en el parénquima cerebral en un área altamente vascularizada en ratones LV, mientras que la infección por LACV se restringió principalmente a la luz vascular a 4 ppp en ratones LP (Fig. 6f, paneles del lado derecho). En particular, las partículas de virus se restringieron dentro de los vasos sin establecer una fuga suficiente dentro del parénquima cerebral a 4 ppp. Por lo tanto, el tratamiento con 4-PBA indujo una regulación positiva de Cx43 y podría restringir parcialmente la infección viral y la diseminación en la región OB/OT en la etapa temprana de la infección por LACV.

La susceptibilidad relacionada con la edad a la infección por LACV depende, en parte, de la capacidad de LACV para inducir fugas vasculares y obtener acceso al SNC16. En este estudio, adoptamos un enfoque sistemático de "detección dirigida" para descubrir las diferencias en la expresión génica entre fragmentos de microvasos de destete y adultos (ex vivo)/BCEC (in vitro) que pueden contribuir a la susceptibilidad diferencial de LACV. Los análisis transcriptómicos demostraron que los genes podían dividirse en varios grupos específicos de edad, relacionados con el sistema inmunitario o específicos de ubicación cerebral. Luego usamos una biblioteca de siRNA específica para investigar el papel de esos factores en el control de la infección viral y la muerte celular asociada. A partir de la pantalla de seguimiento, el estudio de validación y los análisis mecánicos, encontramos varios genes, principalmente factores de restricción, que podrían ser importantes para controlar la fuga vascular inducida por LACV en adultos y podrían proporcionar objetivos terapéuticos para mejorar la resistencia a LACV en niños.

Una vía predecible en este modelo de fuga de BCEC habría sido la alteración de las proteínas TJ. Varios virus, incluidos el virus de la hepatitis C y el virus del dengue, utilizan TJ para ingresar a la célula26, mientras que los factores de entrada de LACV se desconocen en gran medida21,27. En nuestra pantalla principal, la eliminación de los TJ Cldn2 y Cldn5 resultó en una reducción de la infección por LACV, mientras que la eliminación de Cldn1 no mostró un efecto significativo. Sin embargo, la influencia de estos genes se estudió en un cultivo monocapa sin estrés. Como la conformación de BCEC es muy importante dentro de los vasos sanguíneos in vivo, la perturbación de TJ podría contribuir a la entrada de LACV en las células susceptibles. En una nota relacionada, observamos que la alteración de la expresión de GJ podría ser un factor importante para controlar la infección por LACV y el daño a las BCEC. Observamos específicamente que una de las principales proteínas GJ endoteliales del cerebro, Cx43, expresada por Gja1 mRNA28 ayuda a controlar la infección por LACV en células bEnd.3.

A partir del RNA-seq, la pantalla de siRNA dirigida y otros análisis de seguimiento, estudiamos varios genes que no están directamente involucrados en el mantenimiento de las uniones celulares, incluidos Bst1, Clec4e, Efna2, H2q6, Ifitm3 y Ly6c2. Aunque Bst1 es un marcador de células madre endoteliales que tienen propiedades regenerativas29 y prevalece en BCEC recién destetadas, este gen no tuvo ninguna función reguladora importante en nuestro estudio. Los reguladores inmunitarios bien caracterizados, como Clec4e, H2q6 e Ifitm3, tienen funciones definidas en LACV u otras infecciones virales. Clec4e induce una respuesta antiviral contra LACV21 y limita la infección viral y la producción de placa (parcialmente) en nuestro estudio30. H2q6, una parte del MHC clase I, tiene funciones importantes en la presentación de antígenos30 y, específicamente en las células endoteliales, modula la red del citoesqueleto de actina y supervivencia celular31,32. La infección por LACV puede conducir a la remodelación de la red de actina16 que puede estar asociada con los efectos citopáticos observados en BCEC cultivados17. Curiosamente, la eliminación de H2q6 produjo una mayor infección viral y una formación de agregación similar a sincitios que se asoció con la fragmentación de la actina F. Ifitm3 es un factor de restricción viral conocido que bloquea la entrada33 o la fusión34 dependiente del pH. En consecuencia, la eliminación de Ifitm3 indujo una mayor intensidad de infección por LACV en BCEC con un mayor número de células infectadas. Aunque Ly6c2 endotelial no tiene un papel informado previamente en la infección viral, observamos una mejora de la unión/entrada viral, infección, replicación y diseminación de LACV con la eliminación de Ly6c2. Aunque centramos nuestro análisis de seguimiento en factores de restricción putativos, Mmp-25 fue el único factor de susceptibilidad putativo mejorado BCEC de destete cuya eliminación redujo la infección viral en BCEC primarios, lo que puede justificar un análisis adicional. En conjunto, estas observaciones sugieren que la susceptibilidad de BCEC a LACV específica por edad está controlada por una red multigénica compleja de factores que facilitan la resistencia del huésped en adultos.

Entre estos factores, Efna2 mejorado para adultos mostró un fenotipo distintivo en el control de la infección viral en células bEnd.3 y BCEC primarias y en la producción de placa viral. Efna2 es una molécula de señalización que pertenece a la familia Ephrin (Efn), que, a través de interacciones con el receptor Eph afín, participa en la angiogénesis y el mantenimiento de las células endoteliales. Efna2 se ha establecido recientemente para desempeñar funciones desde el desarrollo neuronal, la diferenciación y la migración35,36,37 hasta la angiogénesis y la metástasis del cáncer23. En nuestro estudio, observamos que el tratamiento directo de BCEC con rec-EFNA2 redujo la infección viral in vitro. La observación inicial de una mayor susceptibilidad a LACV de ratones adultos Efna2-/- (m) con deficiencia mixta de Efna3/5 sugirió que las moléculas de EphrinA podrían desempeñar un papel en la resistencia a la enfermedad neurológica inducida por LACV. Esto fue confirmado además por la susceptibilidad observada de los ratones KO individuales Efna2-/- (s), lo que sugiere que el gen Efna2 es un factor crítico para la resistencia a LACV en ratones adultos. De manera similar, los BCEC aislados de ratones Efna2-/- (s) fueron más susceptibles a la infección por LACV in vitro y a la muerte celular inducida por la infección. Además, un número significativo de ratones Efna2-/-(s) infectados con LACV mostraron fugas de partículas del tamaño de un virus en el parénquima del SNC. Esto sugiere un papel fundamental para Efna2 al conferir resistencia viral. Si Efna2 podría ser un objetivo in vivo con fines terapéuticos será un tema importante para futuras investigaciones.

Como se señaló anteriormente, las proteínas CJ son objetivos principales para regular la entrada viral a través de la BBB e identificamos el producto del gen Gja1 Cx43 como otro posible factor de restricción. Estudios previos han demostrado que virus como el virus del sarcoma de Rous38, el VIH39 o la infección por el virus de la hepatitis en ratones40,41 pueden modular la expresión y función de Cx43 en diferentes tipos de células. La infección por el virus de la peste porcina clásica también redujo la Cx43 en las células endoteliales42, pero no se ha investigado previamente el papel de la Cx43 y si su potenciación podría limitar la infección por bunyaviral. Con el objetivo de reducir la fuga viral en animales destetados susceptibles, utilizamos 4-PBA, un activador de molécula pequeña conocido y bien caracterizado de Cx4343. El 4-PBA regula al alza una proteína del retículo endoplásmico (ER) luminal de 29 kDa (ERp29)44,45, que controla la biosíntesis y el tráfico de Cx4346. Si bien aún no se ha determinado si la activación de chaperonas como ERp29 es el mecanismo subyacente de la reducción de LACV inducida por 4-PBA en BCEC, esta estrategia representa un enfoque prometedor para combatir la encefalitis inducida por LACV. Cabe señalar que la administración de 4-PBA al inicio de la exposición viral fue suficiente para disminuir la entrada viral y los síntomas neurológicos, lo que puede indicar una respuesta particularmente rápida a este potencial terapéutico.

En resumen, hemos utilizado un enfoque sistemático transcriptómico y de detección de perturbaciones génicas para identificar genes o productos génicos involucrados en el control de la susceptibilidad a LACV de BCEC y la fuga vascular inducida por infección. Identificamos EFNA2 y Cx43 como dos factores importantes que respaldan la resistencia específica de adultos a la infección por LACV. La identificación de dos reguladores moleculares diferentes involucrados en la regulación de la neuroinvasión LACV sugiere sinergismo entre múltiples efectores que regulan las diferencias entre la BBB inmadura y madura que impactan la capacidad de virus como LACV para acceder al SNC y causar enfermedad neuroinvasiva.

Todos los estudios en animales se realizaron bajo el protocolo animal RML-2018-018-E, LISB 3E y LISB 4E, adhiriéndose a los Principios de cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con la aprobación del Comité institucional de cuidado y uso de animales NIH/NIAID/RML. En este estudio no se utilizaron muestras humanas. El rango de temperatura tanto dentro de la jaula de animales como en la sala de espera de los animales fue de 20 a 24 °C y el rango de humedad fue de 30 a 70 %. Se mantuvo en todo momento un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (6 am-6 pm). Todos los ratones fueron sacrificados después del experimento.

Se trataron ratones destetados (~3 semanas de edad) y adultos (>6 semanas de edad) con 100 ug de Poly I:C (HMW) diluido en una solución de reactivo de transfección LyoVec de 0,5 mg/ml (Invivogen) a través de 100 ul de retroorbital (IV). ) inyección. El reactivo LyoVec se reconstituyó con el agua estéril desionizada provista según las recomendaciones del fabricante y se usó solo como control del vehículo. Los fragmentos de microvasos se retiraron de los animales tratados y del vehículo 3 horas después de la inyección. Para comparar la expresión del transcrito de fragmentos de microvasos OB frente a CT de LACV y condiciones de infección simulada, se infectaron ratones C57BL/6 recién destetados con una dosis IP de 2000 UFP de LACV diluida en 200 ul de PBS estéril de calidad farmacéutica. Los ratones simulados recibieron un volumen equivalente de sobrenadante Vero no infectado diluido en PBS. Se aislaron fragmentos de microvasos de OB y ​​CT de LACV y ratones infectados simulados a 3 ppp. Los ARN se extrajeron de fragmentos de microvasos como se describe a continuación y se purificaron utilizando perlas Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, Brea, CA). La concentración de ARN se midió utilizando el método de cuantificación de ARN fluorescente RiboGreen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). La pureza y la integridad del ARN se evaluaron mediante espectrofotometría UV Nanodrop 8000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) y el ensayo de chip Bioanalyzer RNA 6000 Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectivamente. Las bibliotecas de secuenciación se generaron a partir de 115 ng (adulto/destete) o 170 ng (OB/CT) de ARN utilizando el kit de preparación de muestras de ARNm de cadena TruSeq, de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Illumina, Inc., San Diego, CA). Las bibliotecas TruSeq purificadas finales se cuantificaron con el kit Kapa SYBR FAST Universal qPCR para secuenciación Illumina (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), se diluyeron a 2 nM y se agruparon por igual. Las bibliotecas se secuenciaron en el instrumento HiSeq 2500 con el kit TruSeq Rapid PE Cluster y el kit Rapid 200 Cycle SBS (Illumina, Inc., San Diego, CA).

Las secuencias del adaptador se eliminaron de los archivos fastq sin procesar con CutAdapt47 y se filtraron por calidad y se recortaron con el kit de herramientas FASTX 0.0.14 (Hannon Lab, CSHL, RRID:SCR_005534). Las lecturas recortadas y filtradas por calidad se mapearon a la secuencia de referencia del ratón GRCm38 utilizando Hisat2 versión 2.1.0 con configuraciones de parámetros sin mezcla48. Los archivos de alineación se utilizaron como entrada para el recuento de HTSeq de la biblioteca de Python HTSeq versión 0.9.149 para generar recuentos de genes utilizando el archivo de anotación de referencia GRCm38. Las matrices de conteo sin procesar se usaron como entrada para el análisis de expresión diferencial usando DESeq250. Los genes se clasificaron según el cambio de pliegue logarítmico reducido (lfc) de DESeq y el valor de p ajustado. Los datos adquiridos se filtraron usando significación estadística, media base (recuento de lectura de genes diana) y cambio de log2 y se introdujeron en R (versión 3.6.0), Ingenuity Pathway Analysis (IPA, versión 84978992, Qiagen) y SIGNAL (versión 2.0)51 para comprender las vías y los genes implicados en los efectos inmunoestimuladores dependientes de la edad en los microvasos cerebrales. Al comparar diferentes grupos, se seleccionaron aproximadamente 50 genes para su posterior análisis en la infección por LACV.

Todos los estudios con animales se realizaron bajo el protocolo animal RML-2018-018-E, LISB 4E y LISB 3E, adhiriéndose a los Principios de cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con la aprobación de NIH/NIAID/RML o NIH/NIAID/Bethesda Institutional Animal Comité de Cuidado y Uso. Se mantuvieron ratones C57BL/6 (obtenidos de Jackson Laboratories) o Efna2-/- (m) o Efna2-/-(s) en una colonia de reproducción en RML o Bethesda Campus. Se usó stock de LACV humano de 1978, un amable obsequio del Dr. Richard Bennett, para estudiar la patogénesis de LACV en los ratones1, ya que se diluyó a la dosis adecuada en 200 µl de PBS estéril de grado farmacéutico para la inoculación. A los animales destetados (de ~3 semanas de edad) se les inoculó IP con una dosis baja de 2000 UFP/ratón, mientras que a los adultos (de > 6 semanas de edad) se les inoculó IP con 105 UFP. Los ratones inoculados de forma simulada se inocularon con 200 ul de PBS con la cantidad apropiada de sobrenadante celular de células Vero no infectadas para igualar el volumen de las diluciones de virus. Los cerebros completos o las regiones OB-CT se aislaron por separado de LACV y ratones inoculados de forma simulada a 3 ppp. La Tabla complementaria 4 representa la abreviatura de la mayoría de los grupos experimentales y otras nomenclaturas utilizadas en este manuscrito.

Se aislaron y cultivaron microvasos cerebrales como se describió previamente17. Brevemente, después de la perfusión transcardial con PBS estéril, se aislaron cerebros completos de ratones recién destetados y adultos, y luego se cortaron en trozos pequeños. Luego se realizó una digestión de 1 h en las piezas de cerebro usando 10 mg/ml de colagenasa (CLS2; Worthington Biochemical) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma) en una incubadora-agitadora a 37 °C. Los tejidos digeridos se separaron de los restos celulares y los lípidos de la sustancia blanca mediante centrifugación a 1000 g durante 20 min, en presencia de una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 20 % preparada en DMEM. Se añadió una solución de 10 mg/ml de colagenasa/dispasa (Roche Applied Science) en DMEM al sedimento resultante y se incubó durante 45 min a 1 h a 37 °C. Los fragmentos de microvasos obtenidos en este paso se separaron en un gradiente continuo de Percoll al 33 % que se centrifugó a 1000 g durante 10 min. Finalmente, los fragmentos de microvasos se recolectaron y lavaron dos veces en DMEM antes de usarlos para experimentos ex vivo e in vitro. Para la comparación de OB y ​​CT, esas regiones específicas se aislaron usando pinzas de punta fina y se siguió el mismo protocolo que el anterior para aislar fragmentos de microvasos de estas diferentes regiones del cerebro.

Los fragmentos de microvasos se sembraron en portaobjetos con cámaras o placas de múltiples pocillos recubiertas con colágeno tipo IV (Sigma) y fibronectina humana (Sigma). Se usó DMEM suplementado con suero bovino fetal al 20 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, glutamina al 1 %, 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (R&D Systems) y 4 μg/ml de puromicina (Sigma) para cultivar BCEC primarias incubadas en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 y 95 % de aire a 37 °C. La línea de células endoteliales de ratón, bEnd.3 (ATCC, CRL-2299) se cultivó de manera similar utilizando DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y glutamina al 1 %. Para los experimentos in vitro, se inocularon monocapas confluentes con diferentes MOI de LACV (para estandarización), y se usó un MOI de 10 para los experimentos. Después de 1,5 h, se añadió encima medio fresco y las células se analizaron en los puntos de tiempo deseados. Las muestras inoculadas simuladas se mantuvieron en paralelo.

El ARN total se aisló de fragmentos de microvasos aislados ex vivo o de BCEC cultivadas utilizando kits de aislamiento de ARN de Zymo Research, siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN total se trató con ADNasa I (Invitrogen) durante 30 min a 37 °C y se purificó en columnas de limpieza de ARN (Zymo Research). Los ADNc se prepararon a partir de muestras de ARN limpias utilizando el kit de transcripción inversa iScript (Bio-Rad Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADNc se diluyeron cinco veces en agua libre de ARNasa y esas muestras diluidas se usaron para el análisis de expresión génica mediante qPCR usando SYBR Green SuperMix con ROX (Bio-Rad Laboratories). Para todos los análisis, se utilizó Gapdh como control de genes domésticos. Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla complementaria 5.

Los cerebros de los ratones, tras la extracción quirúrgica, se almacenaron a -80 °C hasta que se descongelaron con el tampón de lisis proporcionado en Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen). Los cerebros se homogeneizaron utilizando un TissueRuptor (Qiagen) y la extracción de ARN se realizó utilizando el protocolo del fabricante y utilizando el mismo kit. La concentración se midió con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y el ADNc se sintetizó con un kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories). Se usó la misma cantidad de ADNc para PCR en tiempo real usando el sistema de ensayo SYBR Green (Applied Biosystems) para medir el ARN de LACV o los ensayos de PCR en tiempo real TaqMan (Thermo Scientific) para detectar Gja1 usando el protocolo del fabricante. Se tomaron los controles de genes de mantenimiento apropiados y se midieron los valores de CT utilizando una máquina QuantStudio 6 Flex (Applied Biosysterms) o un sistema Applied Biosystems ViiA 7. Se utilizó el software QuantStudio Real-Time PCR para extraer los datos.

Las proteínas de las células bEnd.3 se extrajeron a 96 hpi (10 MOI de dosis de inóculo de LACV) utilizando tampón RIPA (Thermo Scientific) con un cóctel de inhibidores de proteasa (cOmplete Tablets, Mini, EDTA-free, Roche) y un cóctel de inhibidores de fosfatasa (PhosSTOP EASY Pack, Roche) y la concentración de proteína se midió utilizando un kit de ensayo BCA (Thermo Scientific). La inmunotransferencia se realizó utilizando Cx43 (1:500, suero policlonal, Sigma) y Gapdh (1:1000, AbCam) como control de normalización. Los escaneos sin recortar y sin procesar de transferencias occidentales se incluyen en la Fig. 6 complementaria.

Las células BCEC primarias y bEnd.3 se cultivaron en monocapas confluentes y las transfecciones de ARNip se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizó reactivo de transfección TransIT-TKO (Mirus Bio.) para la mayoría de los experimentos (2 ul/pocillo de placa de 96 pocillos) junto con 50 nM de concentraciones finales de siRNA. Se usaron 100–200 ul del volumen total de reacción por pozo y se incubaron en una incubadora (5 % de CO2 humidificado, 95 % de atmósfera de aire) a 37 °C. Después de ~ 72 h después de la transfección, se comprobó visualmente la eficacia de la transfección de las células (comparando si-Lethal y si-NT) y se llevaron a cabo más experimentos. A excepción de los siRNA de control, utilizamos dos secuencias de siRNA independientes para cada gen con tres réplicas cada una. Los siRNA utilizados en este estudio se describen en la Tabla complementaria 5.

Se inocularon ratones WT o Efna2-/- (m) con una dosis de 105 UFP/ratón de LACV (IP). A los 3 ppp, a estos ratones se les inyectó de forma retroorbital (intravenosa; IV) microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres de 100 nm (Thermo Scientific). Los ratones fueron sacrificados después de 30 min. Por anestesia seguida de perfusión transcardial. Se tomaron los cerebros de los ratones, se procesaron de manera similar para las criosecciones. Las criosecciones se contrastaron con Hoechst, después de rehidratar los portaobjetos con PBS. Después del montaje, se utilizó un microscopio de epifluorescencia Leica DMI 6000B y el software LAS-X para capturar imágenes.

Se disolvieron 4-PBA (Sigma) y rec-EFNA2 (Sino Biological) en medio de cultivo regular para el tratamiento de células. Se usó dimetilsulfóxido (DMSO; (< 0,5%)) cuando se observó cualquier material particulado en la concentración más alta de 4-PBA (10 mM). Siguiendo las recomendaciones de un informe anterior52, utilizamos una dosis máxima de 500 mg/kg-día y se tomó precaución para evitar la muerte de animales inducida por la toxicidad del fármaco. A los ratones destetados (~10 g) se les inyectó 4-PBA (500 mg/kg-día) que se disolvió en aceite de maíz (con 200–300 ul de DMSO/10 ml) y se administraron diariamente ~200 ul de inyección IP. Los ratones se pesaron diariamente y el volumen de inyección se ajustó en consecuencia. A los ratones del vehículo se les inyectó de manera similar la solución de aceite de maíz complementada con DMSO en ausencia de 4-PBA.

Los ratones Efna2-/- (m) o Efna2-/- (s) fueron amablemente donados por el Prof. David Feldheim (Universidad de California, Santa Cruz). Los ratones fueron endogámicos y se verificaron los genotipos usando el siguiente método: Los cebadores Ephrin A2 son A2-1: 5'-CCG CTT CCT CGT GCT TTA CGG TAT C −3', A2-2: 5'-GGG CCG GTT GCA TTC CCA GCG–3' y A2-3: 5'-GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC–3' donde WT es detectado por A2-2 y A2-3: 200 pb y Efna2 mutante es detectado por A2-1 y A2-2: 500 pb. Los cebadores Ephrin A3 son A3-1: 5'-GGC TTT TTC TAC AAT CTT TTC TCA – 3', A3-2: 5'-TCA TGT AGG AGA TAC AGG GC – 3' y A3-3: 5'-ACC AAA GAA CGG AGC CGG TTG GCG – 3' donde WT es detectado por A3-1 y A3-2: 500 pb y el mutante Efna3 es A3-2 y A3-3: 200 pb. Los cebadores Ephrin A5 son A5-1: 5'-AGC CCA GAA AGC GAA GGA GCA AAG C –3', A5-2: 5'-ATT CCA GAG GGG TGA CTA CCA CAT T –3' y A5-3: 5' -TCC AGC TGT GCA GTT CTC CAA AAC A –3' donde WT es detectado por Wild Type A5-2 y A5-3: 400 bp y mutante es detectado por A5-1 y A5-3: 500 bp. Todos estos detalles de los cebadores se compartieron con Transnetyx para desarrollar un ensayo de genotipado automatizado para Efna2, Efna3 y Efna5 y los genotipos se obtuvieron a partir de ellos.

Los estudios de inmunofluorescencia se realizaron de acuerdo con un protocolo descrito previamente17. Para la inmunofluorescencia estándar, las células BCEC primarias o bEnd.3 se sembraron en una placa de pocillos múltiples o en un portaobjetos de vidrio con cámara. Las muestras se fijaron utilizando paraformaldehído (PFA) al 4 % en PBS, seguido de la permeabilización de las células con PBS que contenía Triton X-100 al 0,5 %. Luego, las células se bloquearon con PBS que contenía un 5 % de suero de burro inactivado por calor y un 0,5 % de Triton X-100. Después de la incubación con antisueros primarios (diluidos en solución de bloqueo) durante 1 h (RT) o toda la noche (4 °C), los anticuerpos unidos de forma no específica se eliminaron por lavado con suero de bloqueo. Finalmente, las muestras se marcaron con antisueros secundarios diluidos en solución de bloqueo, se lavaron con PBS y se incubaron con tinción de Hoechst durante 10 min. Las muestras se montaron usando Fluoromount-G (Southern Biotech) y se secaron para curar a temperatura ambiente en la oscuridad y se almacenaron a 4 °C para uso a largo plazo o se almacenaron con PBS en un refrigerador a 4 °C. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio CX7 (Thermo Scientific) o un microscopio confocal invertido Leica DMI8000 (Chicago, IL). Las imágenes y los datos de cuantificación se adquirieron y/o procesaron con el software Cellomics (máquina Cx7), LAS X (para microscopio confocal y de epifluorescencia Leica), Fiji (1.52n).ImageJ (1.52a, NIH) o Imaris 8 (Bitplane, Suiza) ) o software FlowJo 10.8.1. Se utilizaron Graph Pad Prism 8 y 9 y Microsoft Excel (2010).

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con PBS y se extrajeron los cerebros. Luego, los cerebros se fijaron en formalina tamponada neutra (NBF) al 10 % durante 24 horas, seguido de equilibrar los cerebros en sacarosa al 10 % y luego en sacarosa al 30 %. Después de la crioprotección, los cerebros se montaron utilizando el compuesto Tissue Plus OCT (Fisher HealthCare), se congelaron y se obtuvieron secciones de 10 um utilizando un criotomo CM1 950 (Leica Microsystems). Luego, las secciones se tiñeron con anticuerpo LACV (1:500–1:800) o un anticuerpo ZO1 (1:250, Thermo Scientific) utilizando un método descrito anteriormente41 con modificaciones menores. Brevemente, las secciones de tejido congeladas se lavaron con etanol al 95 % enfriado con hielo y luego con PBS a temperatura ambiente (TA) para eliminar la criomatriz. Se usó un rotulador hidrofóbico para crear límites alrededor de las secciones. A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS (3 veces) y se incubaron con suero de bloqueo (PBS con Triton X-100 al 0,5 % y suero de burro al 5 %) a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el antisuero primario que se diluyó en suero de bloqueo. Las secciones se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con antisuero secundario diluido en suero de bloqueo durante 2 ha TA. Todas las incubaciones se realizaron en una cámara humidificada. Finalmente, después de 3 lavados con PBS, los núcleos se contratiñeron con Hoechst. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal invertido Leica DMI8000 (Chicago, IL). Las imágenes se procesaron con el software ImageJ (1.52a, NIH), Fiji (1.52n, NIH) o Imaris 8 (Bitplane, Suiza).

Los sobrenadantes de los cultivos bEnd.3 infectados así como inoculados de forma simulada se recogieron a diferentes hpi. Los ensayos de placa se realizaron utilizando un método descrito previamente17. En resumen, las monocapas de células Vero se inocularon con diferentes diluciones de sobrenadantes en DMEM suplementado con FBS al 2 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Se añadió MEM que contenía 1,5 % de carboximetilcelulosa (CMC) después de 1 hora y se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 y 95 % de aire. A los 5 dpi, las células se fijaron con una solución de formalina al 10 %, se lavaron y las placas se visualizaron con una solución de cristal violeta al 0,35 %.

Las células bEnd.3 se tomaron en hpi específico y la viabilidad celular se midió usando el reactivo CellTiter-Glo (Promega), usando el protocolo del fabricante. La luminiscencia se midió usando FLUOstar Omega (BMG Labtech). Alternativamente, el recuento de células se midió a partir del número de núcleos (teñidos por Hoechst) utilizando un generador de imágenes Cx7 (Thermo Scientific).

Las monocapas confluentes de células bEnd.3 se preenfriaron a 4 °C y las células se infectaron con 10 MOI de inóculo de LACV en hielo. Las células se mantuvieron a 4 °C durante 2 a 3 h para permitir que las partículas virales solo se adhirieran a la superficie celular pero no se replicaran a la temperatura reducida. El inóculo se retiró con precaución y las células se lavaron minuciosamente (2 o 3 veces) a 4 °C. A continuación, se añadió medio de cultivo fresco encima y las células se llevaron a 37 °C. A continuación, se permitió que el virus adherido se amplificara en las células a la temperatura aumentada hasta las 24 hpi y se analizó la intensidad de LACV usando un ensayo de inmunofluorescencia.

En cada experimento se muestra la media ± SD o los puntos de datos individuales con la media. Para los análisis de RNA-seq, se realizó un modelo generalizado binomial negativo con la prueba de Wald para la significación. Los valores de p bilaterales se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini Hochberg. El ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey o las pruebas de comparación múltiple de Dunnett se realizan como análisis post-hoc para la comparación de medias múltiples o la comparación de medias de control. Se realizan múltiples pruebas t pareadas o no pareadas en comparaciones de dos grupos o análisis de detección. Las comparaciones de supervivencia se realizaron mediante la prueba Log-rank (Mantel-Cox). Los detalles de los análisis estadísticos se proporcionan en leyendas de figuras individuales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq se depositaron en Gene Expression Omnibus (GEO) y están disponibles públicamente (GSE217434). Hipervínculo al conjunto de datos: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=Gse217434. El software SIGNAL está disponible para el público mediante este hipervínculo: https://signal.niaid.nih.gov/. Los ratones de tipo salvaje (RRID: IMSR JAX:000664 y Strain #:000664) están disponibles en The Jackson Laboratory. Los ratones Efna2-/- están disponibles a pedido en el laboratorio del Dr. Iain Fraser, NIAID. Los otros conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al Prof. David Feldheim (Universidad de California en Santa Cruz) por donar amablemente los ratones Efna2-/- (m) y Efna2-/- (s). Agradecemos a Samuel Katz, Jing Sun y Sharat Vayttaden por su amable asistencia y capacitación para la pantalla transcriptómica, la pantalla dirigida a siRNA y la obtención de imágenes de alto rendimiento, respectivamente. Agradecemos a la Unidad de Genómica de los Laboratorios Rocky Mountain de la Subdivisión de Tecnologías de Investigación del NIAID por su amable asistencia con los análisis de seguimiento y RNA-seq. Agradecemos específicamente a Stacy Ricklef por la preparación de la biblioteca de RNA-seq y el procesamiento de secuencias. También agradecemos a Imaging Core of the NIAID Research Technologies Branch por proporcionar instalaciones de imágenes. Reconocemos y apreciamos a los cuidadores de animales y administradores de instalaciones del NIAID 14BS por su ayuda en el mantenimiento y la crianza de los animales. También agradecemos a James Striebel, Simote Foliaki, Sinu John, Clinton Bradfield y Julia Gross por la lectura crítica del manuscrito y a los miembros del Laboratorio de Enfermedades Virales Persistentes (LPVD), RML y el Laboratorio de Biología del Sistema Inmune (LISB), Bethesda. por sus aportes críticos y su asistencia durante el curso de este trabajo. Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH). RB fue apoyado por la beca RML-Bethesda NIAID.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Karin E. Peterson, Iain DC Fraser.

Sección de Neuroinmunología, Laboratorio de Enfermedades Virales Persistentes, Laboratorios de las Montañas Rocosas, NIAID, NIH, 903 S. 4th Street, MT, 59840, Hamilton, EE. UU.

Rahul Basu, Clayton W. Winkler y Karin E. Peterson

Sección de Sistemas de Señalización, Laboratorio de Biología del Sistema Inmune, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Rahul Basu y Iain DC Fraser

Rama de Tecnologías de Investigación, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, 4 Memorial Drive, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Sundar Ganesan

Sección de Investigación Genómica, Rama de Tecnologías de Investigación, División de Investigación Intramural, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud, 903 S. 4th Street, MT 59840, Hamilton, MT, EE. UU.

sarah l anzick y craig martens

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RB realizó los experimentos y escribió el manuscrito. SG ayudó con la adquisición, procesamiento y análisis de imágenes confocales. CW realizó todos los experimentos relacionados con el análisis de RNA-seq. SLA y CM realizaron, analizaron e inventariaron los datos de RNA-seq y ayudaron con los análisis de datos de pantalla transcriptómica (análisis IPA, preparación de gráficos de volcanes, etc.). KEP e IDCF diseñaron el proyecto, supervisaron los experimentos y escribieron el manuscrito. KEP e IDCF contribuyeron por igual. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Karin E. Peterson o Iain DC Fraser.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Todos los autores han aprobado la presentación de este manuscrito.

Nature Communications agradece a Andrew MacLean y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Basu, R., Ganesan, S., Winkler, CW y col. Identificación de genes reguladores específicos de la edad de la neuroinvasión y patogénesis del virus La Crosse. Nat Comun 14, 2836 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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Recibido: 07 Agosto 2022

Aceptado: 03 abril 2023

Publicado: 18 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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